Ce protocole permet aux chercheurs de clarifier le comportement planaire et les mécanismes secs sous-jacents à ce comportement en combinant l’analyse comportementale quantitative avec des perturbations moléculaires et chimiques. Cette technique est facilement accessible à tous les niveaux de compétence car elle ne nécessite pas d’instruments avancés ou de logiciels spécialisés pour obtenir des lectures comportementales quantitatives des planaires en mouvement libre. Scrunching peut être utilisé pour étudier l’exception chez les planaires, et sert de point de terminaison sensible à l’essai, perturbant la fonction du système nerveux causée par les xénobiotiques et la maladie.
Commencez par placer un panneau LED dimmable sur une surface plane, qui fournira un fond blanc uniforme et peut être utilisé comme source de lumière réglable pour obtenir un contraste approprié. Placez une arène de boîte de Petri de 100 millimètres sur le panneau LED. Montez une caméra sur un ring au-dessus de l’arène et ajustez sa position, sa hauteur et sa concentration au besoin afin que toute l’arène soit centrée sur le champ de vision et qu’elle soit au point.
Remplissez l’aréna d’environ 25 millilitres du média d’exposition approprié pour avoir un volume maximal, allumez le panneau LED et éteignez toute autre source de lumière qui pourrait nuire à la qualité de l’enregistrement. Déposez un planaire au centre de l’arène à l’aide d’un pipette de transfert. Lors de l’essai d’une solution chimique, transférer le planaire avec le moins d’eau planaire possible, de sorte que la concentration du produit chimique n’est pas significativement changé.
Commencez à enregistrer des données sous forme de séquences d’images dans un format fidjien natif. Pour les expériences de glisse, enregistrez une à deux minutes de comportement de glisse, pour les expériences de gribouillage ou de péristalase, enregistrez suffisamment longtemps pour capturer au moins trois oscillations consécutives se produisant en ligne droite. Une fois l’expérience terminée, terminez l’enregistrement.
Si le planaire atteint la limite de l’aréna sans satisfaire au critère de terminaison, pipette le planaire de retour au centre de l’arène. Ouvrez la séquence d’image brute pour une expérience aux Fidji, convertissez-la en huit bits et utilisez l’outil fléché ou le curseur au bas de la pile d’images pour traverser la séquence d’image. Pour extraire une période de temps et une région d’intérêt, dessinez une région d’intérêt englobant le chemin complet d’un planaire à l’aide de l’outil rectangle.
Cliquez à droite sur la pile d’images et sélectionnez dupliquer, cochez la case où la pile en double. Entrez les première et dernière images de la séquence d’intérêt et cliquez bien. Pour les expériences de glisse, extraire une période de glisse où le planaire se déplace au moins deux fois sa longueur du corps pour les expériences de gribouillage ou de péristase.
Extraire un cas où le planaire subit un minimum de trois oscillations corporelles consécutives et complètes en ligne droite. Appliquez un seuil sur la pile d’images dupliquée pour binariser l’image et extraire le planaire de l’arrière-plan, ajustez les barres coulissantes de sorte que l’ensemble planaire soit mis en surbrillance en rouge. Les valeurs exactes dépendent de la qualité de l’imagerie.
Laissez les boîtes pour le fond foncé, empilez l’histogramme et ne réinitialisez pas la plage sans contrôle. Faites défiler la pile d’images pour assurer une bonne plage de seuil, puis cliquez sur appliquer. Dans la pile de conversion en fenêtre binaire, réglez la méthode par défaut et l’arrière-plan à la lumière.
Décochez toutes les cases de cette fenêtre, puis cliquez bien. Une image binariée montrant un planaire noir sur un fond blanc apparaîtra. Assurez-vous que l’ensemble du planaire est visible dans tous les cadres de la séquence d’image.
Définissez les mesures en cliquant sur analyser et définir les mesures. Cochez les cases pour la zone, le centre de la masse, la position de la pile et l’ellipse d’ajustement, puis cliquez bien. Sélectionnez la pile d’images ouvertes et sélectionnez analyser et analyser les particules.
Dans la fenêtre analyser les particules, sélectionnez afficher et masques pour ouvrir une nouvelle pile montrant tous les objets détectés avec les paramètres choisis. Réglez un filtre de taille pour éliminer le bruit indésirable en entrant dans la zone approximative du planaire. Ensuite, cochez les cases pour afficher les résultats et effacer les résultats et cliquez bien.
Traversez la pile d’images du masque à l’aide du curseur au bas du panneau pour vous assurer qu’il n’y a pas de bruit ou de cadres sans planaire. Sur la fenêtre de résultats, enregistrez les données à l’aide du fichier et enregistrez comme, ajoutez l’extension CSV au nom du fichier, pour enregistrer les données sous forme de valeurs séparées par virgule. Une fois que les données de la pile d’images sont enregistrées, fermez les résultats respectifs de la pile d’images et masquez les fenêtres.
Pour induire des froissages par la température nocive, chauffer l’eau planaire dans un bécher en verre à 65 degrés Celsius sur une plaque chauffante. Placez un planaire au centre de l’arène, et attendez qu’il s’oriente droit et commence à glisser, puis commencer l’enregistrement. Utilisez une pipette P 200 pour pipette lentement et uniformément 100 microlitres de l’eau planaire préchauffée, post pharyngée sur l’extrémité arrière du planaire pour induire des gribouillages.
Arrêtez l’enregistrement, une fois que le gribouillage a cessé. Placez le planaire dans un récipient de récupération et échangez les médias dans la boîte de Petri avec de l’eau planaire fraîche à température ambiante, si vous courez plus d’expériences. Pour provoquer des gribouillages par amputation, transférez un planaire au centre de l’arène et attendez que le planaire s’oriente droit et commence à glisser.
Puis commencer l’enregistrement, amputer le planaire avec une lame de rasoir propre. S’assurer que l’emplacement de coupe est cohérent entre les expériences. Arrêtez l’enregistrement une fois que la pièce antérieure a cessé de gribouiller.
Retirer les deux morceaux, les placer dans un récipient séparé et leur permettre de se régénérer pendant sept jours. Les planaires amputés peuvent être réincorporés dans le contenant de la maison une fois qu’ils se sont régénérés. Ce protocole a été utilisé pour tester si près de l’exposition à la lumière UV, induit scrunching dans S.mediterranea et D.japonica planarians, tandis que D.japonica planarians scrunch, lorsqu’ils sont exposés à la lumière UV proche, Planarians S.mediterranea soit montrer amincissement de la queue ou pas de réponse.
Une quantification des paramètres de gribouillage pour les planariens D.japonica qui ont montré au moins trois scrunches consécutives en ligne droite, révèle des caractéristiques scrunching paramètres pour cette espèce En contraste exposition à 250 micromolar cinnamaldehyde inconnu TRPA un agoniste chez la souris, provoque scrunching et S.mediterranea. Alors que les planariens de D.japonica affichent un mélange de mouvement serpentin et oscillatoire interrompu par des virages à la tête glissants ou vigoureux. Une quantification des échantillons avec au moins trois oscillations consécutives, a donné des valeurs significativement inférieures pour trois paramètres sur quatre alors prévus pour le scrunching dans D.japonica, indiquant que le mouvement oscillatoire observé n’est pas scrunching.
RNAi confirme la spécificité du scrunching et de la réponse à l’exposition de cinnamaldehyde dans S.mediterranea. Dans les 180 secondes qui ont été exposées dans l’eau planaire, tous les RNAi de contrôle se sont griffonnés. Comparé à aucun des planaires de RNAi de SMTRPA démontrant que le scrunching de S.mediterranea dans le cinnamaldehyde exige SMTRPA un.
Il est essentiel d’être cohérent et comment les animaux sont manipulés pour réduire le bruit et assurer la reproductibilité dans les mesures comportementales. Ces projets peuvent être élargis pour inclure l’analyse de la forme du corps, ce qui permettrait l’identification et la quantification d’autres comportements planaires qui ne sont pas capturés ici.
