פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים להבהיר את ההתנהגות המתכננת ואת המנגנונים השניים שבבסיס התנהגות זו על ידי שילוב של ניתוח התנהגותי כמותי עם הפרעות מולקולריות וכימיות. טכניקה זו נגישה בקלות לכל רמות המיומנות כפי שהוא אינו דורש מכשירים מתקדמים או תוכנה מיוחדת כדי לקבל קריאה התנהגותית כמותית של planarians נע חינם. Scrunching יכול לשמש כדי ללמוד חריגים ב planarians, ומשמש נקודת קצה רגישה כדי להתבונן, שיבוש תפקוד מערכת העצבים הנגרמת על ידי קסנוביוטיקה ומחלות.
התחל על ידי הצבת לוח LED מעומעם על משטח שטוח, אשר יספק רקע לבן אחיד והוא יכול לשמש כמקור אור מתכוונן כדי להשיג ניגודיות מתאימה. מניחים 100 מילימטר זירת צלחת פטרי על לוח LED. הר מצלמה על עמדת טבעת מעל הזירה והתאם את מיקומה, גובהה ומיקודה לפי הצורך, כך שהזירה כולה מרוכזת בתחום הצפייה וממוקדת.
מלא את הזירה בכ-25 מיליליטר של מדיית החשיפה המתאימה כדי שיהיה לה עוצמת קול מרבית, הפעל את לוח ה-LED וכבה מקורות אור אחרים שעלולים להשפיע לרעה על איכות ההקלטה. זרוק פלנרית במרכז הזירה באמצעות העברה פיפטה. בעת בדיקת פתרון כימי, להעביר את planarian עם מעט מים פלנריים ככל האפשר, כך הריכוז של הכימיקל אינו משתנה באופן משמעותי.
התחל להקליט נתונים כרצפי תמונות בתבנית פיג'י מקורית. עבור ניסויי גלישה, להקליט 1-2 דקות של התנהגות גלישה, עבור סקרנצ'ים או ניסויים פריסטואליים, להקליט מספיק זמן כדי ללכוד לפחות שלוש תנודות רצופות המתרחשות בקו ישר. לאחר השלמת הניסוי, סיים את ההקלטה.
אם התוכנית תגיע לגבול הזירה מבלי לספק את קריטריון הסיום, תחזור התוכנית למרכז הזירה. פתחו את רצף התמונות הגולמי לניסוי בפיג'י, המירו אותו לשמונה סיביות ולהשתמש בכלי החץ או המחוון בתחתית ערימת התמונות כדי לעבור דרך רצף התמונה. כדי לחלץ פרק זמן ואזור עניין, צייר אזור מעניין המקיף את הנתיב המלא של תוכניתן באמצעות כלי המלבן.
לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על מחסנית התמונות ובחר כפול, סמן את התיבה שבה מחסנית כפולה. הזן את המסגרות הראשונות והאחרונה של רצף העניין ולחץ על אישור. עבור ניסויי גלישה, לחלץ תקופה של גלישה שבו planarian נע לפחות פעמיים אורך הגוף שלה עבור סקרנצ'ר או ניסויים פריסטואלית.
לחלץ מופע כאשר planarian עובר מינימום של שלוש תנודות גוף רצופות ומלאות בקו ישר. החל סף על מחסנית התמונה המשוכפלת כדי להפוך את התמונה למחסנית ולחלץ את הפלנרית מהרקע, להתאים את סרגלי ההזזה כך שהפלנרית כולה תסמן באדום. הערכים המדויקים תלויים באיכות ההדמיה.
השאר את התיבות לרקע כהה, ערם היסטוגרמה ואל תאפס את הטווח ללא סימון. גלול לאורך מחסנית התמונות כדי להבטיח טווח סף טוב ולאחר מכן לחץ על החל. בחלון המר מחסנית לחלון בינארי, הגדר את פעולת השירות כברירת מחדל ואת הרקע לאור.
בטל את סימון כל התיבות בחלון זה ולאחר מכן לחץ על אישור. תמונה בינארית המציגה לוח שחור על רקע לבן תופיע. ודאו שהתוכנית כולה גלויה בכל המסגרות של רצף התמונות.
הגדר מידות על-ידי לחיצה על נתח והגדרה של מידות. סמן את התיבות עבור אזור, מרכז המסה, מיקום הערימה והתאים אליפסה ולאחר מכן לחץ על אישור. בחר את מחסנית התמונות הפתוחה ובחר לנתח ולנתח חלקיקים.
בחלון ניתוח חלקיקים, בחר הצג ומסכות כדי לפתוח מחסנית חדשה המציגה את כל האובייקטים שזוהו עם הפרמטרים שנבחרו. הגדר מסנן גודל כדי להסיר רעש לא רצוי על-ידי הזנת האזור המשוער של התוכנית. לאחר מכן סמן את התיבות לקבלת תוצאות תצוגה ונקה תוצאות ולחץ על אישור.
גלילה בערימה של תמונת המסיכה באמצעות המחוון בתחתית החלונית כדי לוודא שאין רעש או מסגרות ללא לוח. בחלון התוצאות, שמור את הנתונים באמצעות קובץ ושמור בשם, הוסף את סיומת ה- CSV לשם הקובץ, כדי לשמור את הנתונים כערכים מופרדים באמצעות פסיקים. לאחר נשמרים הנתונים עבור מחסנית התמונות, סגור את תוצאות מחסנית התמונות וחלונות המסיכה המתאימים.
כדי לגרום לקרצוף באמצעות טמפרטורה מזיקה, מחממים מים פלנריים ב זכוכית ל-65 מעלות צלזיוס על צלחת חמה. מניחים פלנרי במרכז הזירה, ומחכים עד שהיא מתבונה זקוף ומתחיל לגלוש, ואז להתחיל להקליט. השתמש P 200 פיפטה לאט ובעקביות pipette 100 microliters של מים פלנריים שחומם מראש, פוסט הלוע על קצה הזנב של planarian כדי לגרום scrunching.
תפסיק את ההקלטה, ברגע שההתכווצות תיפסק. מניחים את הפלנרית במיכל התאוששות ומחליפות את התקשורת בצלחת פטרי עם מים פלנריים טריים בטמפרטורת החדר, אם מפעילים ניסויים נוספים. כדי לגרום לקטיעה באמצעות קטיעה, העבר תוכנית למרכז הזירה והמתן עד שהתכנן יכוון את עצמו זקוף ויתחיל לגלוש.
ואז להתחיל להקליט, לקטוע את planarian עם סכין גילוח נקי. לוודא שמיקום החתך עקבי לאורך ניסויים. עצור את ההקלטה ברגע שהיצירה האחורית חדלה לקרצוף.
מוציאים את שני החלקים, מניחים אותם במיכל נפרד ומאפשרים להם להתחדש במשך שבעה ימים. פלנארים קטועים יכולים להיות מאוגדים מחדש לתוך מיכל הבית ברגע שהם התחדשו. פרוטוקול זה שימש כדי לבדוק אם ליד חשיפה לאור UV, גורם scrunching ב S.mediterranea ו D.japonica planarians, בעוד D.japonica planarians לקרקר, כאשר נחשפים ליד אור UV, S.mediterranea planarians או להפגין דילול זנב או ללא תגובה.
כימות הפרמטרים המגרדים עבור המתכננים D.japonica שהפגינו לפחות שלושה מכווצים קו ישר רצופים, מגלה מאפיינים מגרדים פרמטרים עבור מין זה לעומת חשיפה 250 micromolar cinnamaldehyde ידוע TRPA אגוניסט אחד בעכברים, גורם scrunching ו S.mediterranea. בעוד שמתכנני D.japonica מציגים תערובת של תנועה דמוית נחש ותנודות שנקטעה על ידי גלישה או פניות ראש נמרצות. כימות של הדגימות עם לפחות שלוש תנודות רצופות, הניב ערכים נמוכים משמעותית עבור שלושה מתוך ארבעה פרמטרים אז צפוי לקרצוף D.japonica, המציין כי התנועה תנודות שנצפו אינו מקרצף.
RNAi מאשר את הספציפיות של scrunching ותגובה לחשיפה cinnamaldehyde ב S.mediterranea. בתוך 180 שניות מחשיפה במים פלנריים, כל השליטה RNAi פלנרית מכווצת. בהשוואה לאף אחד SMTRPA אחד RNAi planarians המוכיחים כי S.mediterranea ממורמר cinnamaldehyde דורש SMTRPA אחד.
זה חיוני כדי להיות עקבי וכיצד בעלי החיים הם מניפולציה כדי להפחית את הרעש ולהבטיח רבייה במדידות התנהגותיות. ניתן להרחיב פרויקטים אלה כך שיכללו ניתוח צורת גוף, שיאפשר זיהוי וכמות של התנהגויות פלנריות אחרות שלא נלכדו כאן.
