CRISPR媒介シトシン塩基エディタを用いて点突然変異を効率的に誘導することにより、疾患予防および診断に重要なBRCA1変異体の機能性を同定することができる。この技術の利点は、内因的に発現したBRCA1を直接変異させることであり、これは外因性発現BRCA1を用いた機能的評価の限界を克服する。BRCA1の機能変異の喪失の同定は、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌などのBRCA1突然変異に関連する癌を発症する可能性を予測するために使用することができる。
また、機能的な枯渇によって生存率が低下する必須遺伝子を探すことによって、潜在的な薬物標的を見つけるためにも使用できます。まず、NCBIのGenBankからBRCA1ゲノム配列を取得し、目的の突然変異の周りに、プロトスペーサー隣接モチーフ配列NGGNCCNを用いて20塩基対標的部位を探索する。目的の変異は、ガイドRNA標的配列のPAM-遠位末端に4〜8個のヌクレオチド内に位置する必要があります。
ガイドRNAにつき2つの無料オリゴヌクレオチドを注文する。フォワードオリゴヌクレオチドの場合、ガイド配列の5'末端にCACCGを加え、逆オリゴヌクレオチドに対して、AACを5'末端に、Cを3'末端に加えます。オリゴヌクレオチドを受け取った後、蒸留水で100ミクロモルの最終濃度に再懸濁する。
2つの無料のオリゴヌクレオチドをT4ライゲーションバッファーと10マイクロモルの最終濃度に混合し、95°Cに加熱して室温まで冷却してアニーリングします。制限酵素Bsa1を摂氏37度で1時間消化し、1%アガロースゲルで消化物を実行し、適切なサイズのバンドを精製します。製造者のプロトコルに従って購入したDNAリガーゼを使用して、アニールオリゴヌクレオチド二重鎖をベクターDNAにリゲートし、DH5アルファの有能な細胞に変換します。
1ミリリットルアンピシリンあたり100マイクログラムを含む寒天プレートに形質転換体を加え、摂氏37度で一晩プレートをインキュベートします。いくつかの形質転換体から血漿DNAを精製し、U6プロモーターでプライムするプライマーでサンガーシーケンシングによって誘導RNA配列を分析します。トランスフェクションの1日前に24ウェルプレートでウェル当たり5倍の10〜5個目のHAP1-BE3細胞を播種し、トランスフェクションのために70〜80%の合流に達するように培養します。
トランスフェクトBRCA1ターゲティングガイドRNAは、メーカーのプロトコルに従って購入したトランスフェクション試薬を使用しています。BRCA1標的部位でCGからTAへの変換を誘導するためにBRCA1標的ガイドRNAの1マイクログラムを使用し、3〜4日ごとに37°Cで細胞をインキュベートし、サブカルチャーする。細胞ペレットをトランスフェクション後3、10、24日収穫し、ベース編集効率を分析します。
ゲノムDNA精製キットを用いてゲノムDNAを抽出します。BRCA1標的部位を増幅する最初のPCRプライマーを設計します。最初の PCR 製品のサイズに制限はありませんが、特定の領域を効率的に増幅するために、1 キロベース未満の製品サイズを推奨します。
NGS読み取り長さに応じたアンプリコンのサイズを考慮して、最初のPCR産物の中に位置する第2のPCRプライマーを設計します。NGS分析に必要な配列を付加するために、2番目のPCRプライマーの5'末端に追加の配列を追加します。高忠実度ポリメラーゼを用いて3つの時点から得られたゲノムDNA上のBRCA1標的部位を増幅する。
最初のPCR反応では、15サイクル以上の増幅のために100ナノグラムのゲノムDNAを使用してください。2回目のPCR反応では、20サイクル以上の増幅のために、最初のPCR産物の1マイクロリットルを使用します。2%アガロースゲルで2番目のPCR産物の5マイクロリットルを実行し、サイズを確認します。
次に、テキスト原稿に記載されているプライマーを使用して2番目のPCR産物を増幅することにより、NGS分析に必要な配列を取り付けます。異なるプライマーセットを使用して各サンプルを増幅します。2番目のPCR産物の1マイクロリットルを使用して、高忠実度ポリメラーゼを用いた最大30サイクルの増幅を行います。
2%アガロースゲルでPCR産物を5マイクロリットル実行し、サイズを確認し、市販のPCRクリーンアップキットを使用して増幅を浄化します。NGS ライブラリを作成するには、各サンプルを同じ量で混合します。分光光度計を用いてNGSライブラリを定量化し、再懸濁バッファーまたはpH 8.5で10ミリモルトリス-HClを使用して1ナノモルの濃度に希釈します。
適切な負荷濃度に希釈したライブラリの100マイクロリットルを調製します。対照として、希釈されたサンプルとPhiXを組み合わせた。ライブラリをカートリッジにロードし、製造元のプロトコルに従って NGS を実行します。
ベース編集効率の詳細な分析のために、ターゲットアンプリコンあたり10,000以上の読み取りを取得します。このプロトコルは、CRISPRベースのシトシンベースエディタによって生成された内因性BRCA1変異体の機能評価を行うために使用された。CAS-9およびガイドRNAは、BRCA1を破壊するためにHAP1細胞株にトランスフェクトされ、突然変異頻度を分析した。
HAP1細胞株における変異頻度は時間の経過とともに有意に減少し、BRCA1がこれらの細胞における細胞生存率に必須の遺伝子であることを示す。CGからTA置換変異体がBRCA1の機能に影響を与えるかどうかを調べるため、各変異を誘導し得るDNAプラスミドおよびコーディングガイドRNAはHAP1-BE3細胞株を有するようにトランスフェクトされた。置換周波数を解析した。
3598CからTへの相対的な置換頻度は、ナンセンス突然変異を誘発する病原性変異体であり、劇的に減少した。一方、4527CからTまでのものは、ナンセンス突然変異を誘発する良性変異体であり、時間とともに類似したままであった。これら3つの変異体のヌクレオチド置換頻度は時間依存的に減少することが分かった。
日付の経過に伴う細胞生存率の変化を明確に認識するためには、高い初期突然変異頻度を得る必要があるため、最適化されたトランスフェクション条件を確立することが優先事項である。この手順は、BRCA VUSなどの他の未知の遺伝的変異体を検証するために適用することができる。それは患者由来の未知の変異体の病原性およびそれらの治療への手がかりを提供するかもしれない。
