CRISPR aracılı sitozin bazları düzenleyicisi kullanılarak nokta mutasyonlarını verimli bir şekilde indükleerek, hastalığın önlenmesi ve teşhisi için önemli olan BRCA1 varyantlarının işlevselliği belirlenebilir. Bu tekniğin avantajı, eksojen olarak ifade edilen BRCA1 kullanarak fonksiyonel değerlendirme sınırlamasının üstesinden gelen endojen olarak ifade edilen BRCA1'i doğrudan mutasyona uğratmasıdır. BRCA1'in fonksiyon mutasyonlarının kaybının tanımlanması, meme, yumurtalık, prostat ve pankreas kanserleri gibi BRCA1 mutasyonlarıyla ilişkili kanserlerin gelişme olasılığını tahmin etmek için kullanılabilir.
Fonksiyonel tükenme ile canlılığı azalan temel genler aranarak potansiyel ilaç hedeflerini bulmak için de kullanılabilir. Başlamak için, NCBI'deki GenBank'tan BRCA1 genom dizisini edinin ve 20 baz çifti hedef sahasını protospacer bitişik motif dizisi NGGNCCN ile ilginin mutasyonu etrafında arayın. İlginin mutasyonu, kılavuz RNA hedef dizilerinin PAM-distal ucunda dört ila sekiz nükleotid içinde bulunmalıdır.
Rehber RNA başına iki ücretsiz oligonükleotid sipariş edin. İleri oligonükleotidler için, kılavuz dizisinin 5'ucuna CACCG ekleyin ve ters oligonükleotidler için 5'u sonuna AAC ve 3'u sonuna C ekleyin. Oligonükleotidleri aldıktan sonra, damıtılmış suda 100 mikromolar son konsantrasyona yeniden harcayın.
İki ücretsiz oligonükleotidleri T4 ligasyon tamponu ile 10 mikromolar nihai konsantrasyonda karıştırın ve beş dakika boyunca 95 santigrat dereceye ısıtın, ardından tavlama için oda sıcaklığına soğutun. PRG2'yi 37 santigrat derecede bir saat boyunca Bsa1 kısıtlama enzimini kullanarak sindirin, ardından sindirilen ürünü% 1 agarose jel üzerinde çalıştırın ve uygun büyüklükteki bandı arındırın. Tavlanmış oligonükleotid dubleksi, satın alınan DNA ligazını üreticinin protokolüne göre kullanarak vektör DNA'sına bağlayın ve DH5 alfa yetkin hücrelere dönüştürün.
Transformantları mililitre ampisilin başına 100 mikrogram içeren bir agar plakasına ekleyin ve plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Plazma DNA'sını çeşitli dönüştürücülerden arındırın ve Sanger'ın U6 organizatöründe astarlarla sıralayarak kılavuz RNA dizilerini analiz edin. Transfeksiyondan bir gün önce 24 kuyu plakalarında kuyu başına beş kez 10 ila beşinci HAP1-BE3 hücreleri ve transeksiyon için% 70 ila 80 birışıklığa ulaşmak için kültür.
Üreticinin protokolüne göre satın alınan transfeksiyon reaktiflerini kullanarak BRCA1 hedefleme kılavuzu RNA'ları transfect. BRCA1 hedef sahalarında CG'den TA'ya dönüştürmeyi teşvik etmek için bir mikrogram BRCA1 hedefleme kılavuzu RNA'sı kullanın, ardından hücreleri 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın ve her üç ila dört günde bir alt kültür. Baz düzenleme verimliliklerini analiz etmek için transfeksiyondan üç, 10 ve 24 gün sonra hücre peletlerini hasat edin.
Genomik DNA saflaştırma kitini kullanarak genomik DNA'sı çıkarın. BRCA1 hedef sahalarını güçlendirmek için ilk PCR astarlarını tasarlayın. İlk PCR ürününün boyutunda herhangi bir kısıtlama olmamasına rağmen, belirli bir bölgeyi verimli bir şekilde güçlendirmek için bir kilobases'ten daha küçük bir ürün boyutu önerilir.
NGS okuma uzunluğuna göre ampliconun boyutunu göz önünde bulundurarak ilk PCR ürününün içinde bulunan ikinci PCR astarlarını tasarlayın. NGS analizi için gerekli dizileri eklemek için, ikinci PCR astarlarının 5'uçlarına ek diziler ekleyin. Brca1 hedef bölgelerini, yüksek doğrulukta polimeraz kullanılarak üç zaman noktasından elde edilen genomik DNA'da güçlendirin.
İlk PCR reaksiyonu için, 15 döngü boyunca amplifikasyon için 100 nanogram genomik DNA kullanın. İkinci PCR reaksiyonu için, 20 döngüden fazla amplifikasyon için ilk PCR ürününün bir mikroliterini kullanın. İkinci PCR ürününün beş mikrolitresini%2 agarose jel üzerinde çalıştırın ve boyutunu onaylayın.
Daha sonra metin el yazmasında listelenen astarları kullanarak ikinci PCR ürününü güçlendirerek NGS analizi için gerekli dizileri ekleyin. Farklı astar setleri kullanarak her numuneyi güçlendirin. Yüksek kaliteli bir polimeraz ile 30 döngüye kadar amplifikasyon için ikinci PCR ürününün bir mikroliterini kullanın.
Boyutu doğrulamak ve ticari bir PCR temizleme kiti kullanarak amplicon'u arındırmak için PCR ürününün beş mikrolitresini %2 agarose jel üzerinde çalıştırın. Ngs kitaplığı oluşturmak için her örneği eşit miktarlarda karıştırın. NGS kitaplığını spektrofotometre kullanarak ölçün ve resüspenzyon tamponu veya pH 8.5'te 10 milimolar Tris-HCl kullanarak bir nanomolar konsantrasyonda seyreltin.
Kütüphanenin 100 mikrolitresini uygun yükleme konsantrasyonuna seyreltilmiş olarak hazırlayın. Bir kontrol olarak PhiX'i seyreltilmiş örnekle birleştirdi. Kitaplığı kartuşa yükleyin ve üreticinin protokolüne göre NGS'yi çalıştırın.
Temel düzenleme verimliliğinin derinlemesine analizi için hedef amplicon başına 10.000'den fazla okuma elde edin. Bu protokol, CRISPR tabanlı sitozin baz editörleri tarafından oluşturulan endojen BRCA1 varyantlarının işlevsel bir değerlendirmesini yapmak için kullanılmıştır. CAS-9 ve kılavuz RNA'lar BRCA1'i bozmak için HAP1 hücre hatlarına geçirildi ve mutasyon frekansları analiz edildi.
HAP1 hücre hatlarında mutasyon frekansları zaman içinde önemli ölçüde azaldı ve bu da BRCA1'in bu hücrelerde hücre canlılığı için gerekli bir gen olduğunu gösteriyor. CG ila TA ikame varyantlarının BRCA1'in işlevini etkileyip etkilemediğini araştırmak için, her mutasyonu indükleyebilecek DNA plazmidleri ve kodlama kılavuzu RNA'ları HAP1-BE3 hücre hatlarına sahip olacak şekilde transkr edildi. Ve ikame frekansları analiz edildi.
3598C'nin, saçma bir mutasyona neden olan patojenik bir varyant olan T'ye göreli ikame frekansları önemli ölçüde azaldı. Oysa 4527C'den T'ye, saçma bir mutasyona neden olan iyi huylu bir varyant, zamanla benzer kaldı. Bu üç varyantın nükleotid ikame frekanslarının zamana bağlı olarak azaldığı bulunmuştur.
Tarihin geçmesiyle hücre canlılığındaki değişimi net bir şekilde tanımak için yüksek bir başlangıç mutasyon sıklığı elde etmek gerektiğinden, optimize edilmiş transeksiyon koşullarının oluşturulması önceliklidir. Bu prosedür BRCA VUS gibi bilinmeyen diğer genetik varyantların doğrulanması için uygulanabilir. Hasta kaynaklı bilinmeyen varyantların patojenitesi ve tedavileri hakkında ipuçları sağlayabilir.
