CRISPR 매개 사이토신 베이스 편집기를 사용하여 포인트 돌연변이를 효율적으로 유도함으로써 질병 예방 및 진단에 중요한 BRCA1 변이체의 기능을 식별할 수 있습니다. 이 기술의 장점은 발성된 BRCA1을 직접 돌연변이시키는 것으로, 이는 외인성 발현 BRCA1을 사용하여 기능성 평가의 한계를 극복한다는 것이다. BRCA1의 기능 돌연변이의 손실의 확인은 유방, 난소, 전립선 및 췌장암과 같은 BRCA1 돌연변이와 관련되었던 암발전의 기회를 예측하기 위하여 이용될 수 있습니다.
그것은 또한 그의 생존능력이 기능고갈을 통해 감소되는 필수 유전자를 찾아서 잠재적인 약 표적을 찾아내기 위해 이용될 수 있습니다. 우선, NCBI의 GenBank로부터 BRCA1 게놈 서열을 획득하고 관심의 돌연변이 를 중심으로 프로토스페이서 인접 모티프 서열인 NGGNCCN을 사용하여 20개의 기본 쌍 표적 부위를 검색한다. 관심의 돌연변이는 가이드 RNA 표적 서열의 PAM-말단에서 4~8개의 뉴클레오티드 내에 위치해야 한다.
가이드 RNA당 2개의 무료 올리고뉴클레오티드를 주문하십시오. 전방 올리고뉴클레오티드의 경우, 가이드 서열의 5엔드에 CACCG를 추가하고 역방향 올리고뉴클레오티드에 대해 AAC를 5엔드와 C에 3엔드에 추가한다. 올리고뉴클레오티드를 받은 후 증류수에서 100 마이크로몰라의 최종 농도로 재보종한다.
두 개의 무료 올리고뉴클레오티드를 T4 계합 버퍼와 10 마이크로몰라의 최종 농도에 혼합하고 5 분 동안 섭씨 95도로 가열 한 다음 어닐링을위해 실온으로 냉각하십시오. pRG2를 사용하여 섭씨 37도에서 1시간 동안 PSa1을 소화한 다음, 소화된 제품을 1%의 아가로즈 젤로 실행하고 적절한 크기의 대역을 정화합니다. 제조 자의 프로토콜에 따라 구입 한 DNA 리개아제를 사용하여 벡터 DNA에 아닐드 올리고뉴클레오티드 듀플렉스를 리게이트하고 DH5 알파 유능한 세포로 변환합니다.
밀리리터 암피실린 당 100 마이크로그램이 들어 있는 한천 접시에 변압제를 넣고 밤새 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 여러 변압제에서 플라즈마 DNA를 정화하고 Sanger가 U6 프로모터에서 프라임프라이머로 시퀀싱하여 가이드 RNA 서열을 분석합니다. 종자 5회 10-5회 HAP1-BE3 세포는 1일 전 24웰 플레이트에서 24웰 플레이트에서 70~80%의 결합에 도달한다.
Transfect BRCA1 타겟팅 가이드 RNA 는 제조업체의 프로토콜에 따라 구입한 트랜스페트 시약을 사용한다. BRCA1 표적 가이드 RNA의 마이크로그램 1개를 사용하여 BRCA1 대상 사이트에서 CG를 TA 변환으로 유도한 다음 3~4일마다 섭씨 37도및 하위 배양에서 세포를 배양합니다. 세포 펠릿을 3, 10 및 24일 동안 수확하여 기본 편집 효율성을 분석합니다.
게놈 DNA 정제 키트를 사용하여 게놈 DNA를 추출합니다. BRCA1 대상 사이트를 증폭하기 위해 최초의 PCR 프라이머를 디자인합니다. 첫 번째 PCR 제품의 크기에는 제한이 없지만 특정 영역을 효율적으로 증폭하려면 1킬로베이스 미만의 제품 크기가 권장됩니다.
NGS 판독 길이에 따라 앰플리톤의 크기를 고려하여 제1 PCR 제품 내부에 위치한 두 번째 PCR 프라이머를 디자인합니다. NGS 분석에 필수적인 시퀀스를 부착하려면 두 번째 PCR 프라이머의 5'끝에 추가 시퀀스를 추가합니다. 고충실도 폴리머라제를 사용하여 3시간 지점에서 얻은 게놈 DNA상 BRCA1 표적 부위를 증폭한다.
첫 번째 PCR 반응에 대 한, 사용 100 100 15 주기 에 걸쳐 증폭에 대 한 게놈 DNA의 나노 그램. 두 번째 PCR 반응의 경우 20사이클 이상의 증폭을 위해 첫 번째 PCR 제품의 마이크로리터 1개를 사용하십시오. 2%아가로즈 젤에 제2 PCR 제품의 마이크로리터 5기를 실행하고 크기를 확인합니다.
그런 다음 텍스트 원고에 나열된 프라이머를 사용하여 제2 PCR 제품을 증폭하여 NGS 분석을 위한 필수 서열을 부착합니다. 서로 다른 프라이머 세트를 사용하여 각 샘플을 증폭시합니다. 고충실도 폴리머라제로 최대 30사이클의 증폭을 위해 제2 PCR 제품의 마이크로리터 1개를 사용하십시오.
PCR 제품의 마이크로리터 5척을 2%의 아가로즈 젤에 사용하여 상용 PCR 정리 키트를 사용하여 크기를 확인하고 앰플리턴을 정화합니다. 각 샘플을 동일한 양으로 혼합하여 NGS 라이브러리를 만듭니다. 분광계를 사용하여 NGS 라이브러리를 정량화하고 pH 8.5에서 재서스펜션 버퍼 또는 10 밀리머 트리-HCl을 사용하여 1 나노 몰러의 농도로 희석한다.
적절한 적재 농도로 희석된 라이브러리의 마이크로리터 100개를 준비합니다. 대조군으로서 PhiX를 희석된 시료와 결합하였다. 라이브러리를 카트리지에 로드하고 제조업체의 프로토콜에 따라 NGS를 실행합니다.
기본 편집 효율을 심층 분석하기 위해 대상 앰플리턴당 10개, 000개 이상의 읽기를 얻습니다. 이 프로토콜은 CRISPR 기반 사이토신 베이스 편집기에서 생성된 내인성 BRCA1 변종의 기능적 평가를 수행하는 데 사용되었습니다. CAS-9 및 가이드 RNA는 BRCA1을 방해하기 위해 HAP1 세포주로 전염되었고, 돌연변이 주파수를 분석하였다.
돌연변이 주파수는 HAP1 세포주에서 시간이 지남에 따라 현저하게 감소, BRCA1이 세포에서 세포 생존을위한 필수적인 유전자임을 나타내는. CG에서 TA 대체 변이체가 BRCA1의 기능에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해 각 돌연변이를 유도할 수 있는 DNA 플라스미드 및 코딩 가이드 RNA는 HAP1-BE3 세포주를 갖는 것으로 감염되었다. 그리고 대체 주파수를 분석했다.
3598C에서 T까지의 상대적 대체 주파수는, 말도 안되는 돌연변이를 유도하는 병원성 이체, 극적으로 감소하였다. 4527C에서 T에 대한 반면, 말도 안되는 돌연변이를 유발하는 양성 변이체는 시간과 비슷한 상태를 유지했습니다. 이 세 가지 변이체의 뉴클레오티드 치환 주파수가 시간 의존적인 방식으로 감소하는 것으로 나타났다.
날짜의 경과와 함께 세포 생존가능성의 변화를 명확하게 인식하기 위해서는 높은 초기 돌연변이 주파수를 얻을 필요가 있기 때문에 최적화된 전환 조건을 확립하는 것이 우선이다. 이 절차는 BRCA VUS와 같은 그밖 알려지지 않은 유전 이체를 확인하기 위해 적용될 수 있습니다. 그것은 환자 파생 된 알 수 없는 이체및 그들의 처리의 병원성에 단서를 제공할 수 있습니다.
