この研究は、全国小児病院のアビゲイル・ウェクスナー研究所の高性能コンピューティング施設によって支援されました。この研究は、国立衛生研究所国立がん研究所[U54 CA231641からSLL、R01 CA183776からSLLへ]によってサポートされました。アレックスのレモネードスタンド財団[ERTに若い調査官賞];ペロトニア [ERTへのフェローシップ];国家保健医療研究評議会CJマーティン海外生物医学フェローシップ[APP1111032 to KIP]。

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SLLは、サラリウス・ファーマシューティカルズの諮問委員会のメンバーおよび株式保有者として利益相反を宣言しています。SLLはまた、米国特許第1号に上場した発明者です。米国7,393,253 B2「ユーイング肉腫の診断と治療のための方法と組成」、米国8,557,532「薬剤耐性ユーイング肉腫の診断と治療」。これは、データと資料の共有に関するJoVEポリシーの遵守を変えるものではありません。

発がん性転写因子の生化学的メカニズムを研究することは、それらが引き起こす疾患を理解し、新しい治療戦略を設計するために非常に重要である。これは、融合転写因子をもたらす染色体転座によって特徴づけられる悪性腫瘍において特に当てはまる。これらのキメラタンパク質に含まれるドメインは、野生型タンパク質中に存在する調節ドメインとの有意義な相互作用を欠く可能性があり、融合26、27、28の文脈における構造機能情報の解釈能を複雑にする。さらに、これらの発癌性融合の多くは、低複雑性の本質的に障害ドメイン10、13、29、30によって特徴付けられる。
EWSドメインは、種々の発癌性融合10に関与する、本質的に乱れたドメインの例である。本質的に無秩序で反復的な性質は、EWSドメインで採用されている分子メカニズムを理解する努力を妨げている。構造機能を調査する以前の取り組みは、レポーター遺伝子アッセイの文脈や、関連する細胞コンテキストを再現できない細胞背景において異なる変異体を使用することに大きく頼っており、意味のある部分機能11、17、25を産生する構造的な変化を欠いている。ここで紹介する方法では、これらの問題に対処します。構造機能マッピングは、疾患関連細胞コンテキストで行われ、次世代シーケンシングにより、転写プロファイリングがネイティブクロマチンの設定における転写因子関数を評価することが可能になる。EWS/FLIのDAF変異体の具体的な場合には、DAFは、単離された応答要素を用いたレポーターアッセイにおいてほとんど活性を示さないと報告されたが、レポーターアッセイまたは天然クロマチンのいずれかで、完全な遺伝子プロモーターのコンテキストで活性を示すために、興味深い表現型23を示唆した。ここで説明する方法を使用すると、ゲノム全体のどの種類の調節要素が疾患の設定で最も反応が良いかという問題がより直接的に解決されます。すべての候補標的遺伝子をネイティブクロマチンのコンテキストで同時にテストすることで、トランスクリプトーミックアプローチは部分機能を持つ構築物を同定する可能性が高くなります。
疾患関連の細胞バックグラウンドを使用することの固有の強さは、おそらくこの技術の最大の限界です。最も重要な要因の1つは、これらの実験に適した細胞系を選択することです。病理転写因子を有する悪性腫瘍に由来する多くの細胞株は、その転写因子のノックダウンを容易に許容せず、特に小児癌の場合、起源の真の細胞は依然として議論の余地があり、他の細胞背景における腫瘍遺伝子の発現は非常に有毒である31、32 .これらの場合、研究者が結果の解釈に注意を払い、より疾患に関連する細胞タイプの関連所見を適切に検証する限り、異なる細胞バックグラウンドで実験を行うことが役立つ可能性があります。
オンコジーンの発現の安定性と表現性の結果を慎重に検証し、厳密な基準を満たすシーケンシングのためのサンプルのみを提出することが非常に重要です。ここでは、ノックダウンとレスキューを確認するウェスタンブロットと、陽性制御を検証するために少数の既知の標的遺伝子のqRT-PCRが含まれていました(図2)。また、各バッチを通じて細胞およびRNAの調製を可能な限り同様に行うことにより、できるだけ多くのバッチ変動性を減らすことも重要です。
ここで説明する方法は、研究中の転写因子のゲノム全体の機能に話す他のタイプのゲノムデータと組み合わせると特に強力になります。このタイプの構造機能解析の今後の方向性は、ChIP-seqおよびATAC-seqを含むように拡大し、転写因子の結合性およびクロマチンのアクセシビリティにおける任意の誘発変化を決定するであろう。スイートとして、このタイプのデータは、発癌性転写因子の異なる構造成分が機能の異なる側面(すなわちDNA結合とクロマチン修飾対共調節体の採用)に寄与する場所を指し示すことができます。全体として、NGSベースのアプローチを使用して融合転写因子の構造機能関係をマッピングすることで、これらのタンパク質の発癌機能の生化学的決定因子における新しい洞察を明らかにすることができる。これは、彼らが引き起こす病気の理解を深め、新しい治療戦略の開発を可能にするために重要です。

小児期および青年期の多くの悪性腫瘍を含む癌のサブセットは、新しい融合オンコゲネス1、2、3、4、5、6を生成する染色体転座によって特徴付けられる。得られた融合タンパク質は、しばしば発癌性転写因子として機能し、転写調節の広範な変化を調整して、腫瘍形成7,8を促進する。これらの転位を持つ癌は、一般的に、病理学的融合4、9を除いて、いくつかの反復的なゲノム収差を有する静かな突然変異景観を有する。このように、融合タンパク質を直接標的化することは、これらの疾患における魅力的な治療戦略である。しかしながら、これらの発癌性転写因子は、一般的に、低複雑性、本質的に障害を有し、転写活性化ドメインとDNA結合ドメイン(DBD)10、11、12、13、14と融合したドメインから構成される。これらのタンパク質の本質的に障害のあるドメイン(IDD)とDBDの両方が、従来の薬理学的アプローチで標的にすることは困難であることが証明されています。したがって、新しい治療アプローチの開発には、遺伝子発現を異常に調節するためにこれらの融合によって採用されるメカニズムのより詳細な分子理解が必要である。
EWSR1のN末端IDD部分は、一般に、ユーイング肉腫におけるEWS/FLI、びまん小丸細胞腫のEWS/WT1、軟部10の透明細胞肉腫におけるEWS/ATF1を含む癌におけるDBDに融合する。これらの融合のそれぞれにおける EWS IDD の機械主義的役割は完全に理解されていません。EWS/ETS ファミリ、特に EWS/FLI は、これまでで最も機能的に特徴付けられています。EWS/FLIは、ゲノム全体のエピジェネティックおよび転写変化を調整し、7、11、15、16の遺伝子の活性化と抑制につながる。研究は、IDDが両方の転写共活性化剤(p300、WDR5、およびBAF複合体など)の採用に重要であることを示しているだけでなく、共リプレッサー(NuRD複合体など)11、15、17。FLI1のC末端部分へのEWS IDDの融合は、FLI1のETS DBDに新規なDNA結合特異性を与え、融合オンコプロテイン(EWS/FLI)がコンセンサスETSモチーフ18、19、20に加えてゲノムの反復的なGGAAマイクロサテライト領域に結合するようにする。共同アクティベーター採用機能と組み合わせ、 EWS/FLIのこの創発的なDNA結合活性は、GGAAマイクロサテライトにおけるデノボエンハンサー形成を転写開始部位(TSS)(TSS)(「エンハンサーライク」マイクロサテライト)に促進し、TSSに近位のGGAAマイクロサテライトで転写を促進するRNAポリメラーゼIIを募集する11, 15, 15,151.
これらのデータを組み合わせることで、EWSドメイン内の個別の要素が、異なるタイプのEWS / FLI結合サイトへの明確な共同規制当局の採用に寄与すると仮定しました。しかし、EWS/FLI の EWS 部分内でこれらの要素を識別し、それらの機能を識別することは、ドメインの非常に反復的で乱れた性質によって妨げられています。ここでは、ユーイング肉腫細胞で以前に公開されたノックダウンレスキューシステムを利用して、EWS IDDでこれらの要素を機能的にマッピングします。このシステムでは、EWS/FLIは、FLI1遺伝子の3'UTRを標的とするshRNAを用いて枯渇し、3'UTR7、17、22を欠いた様々なEWS/FLI変異型cDNA構築物で発現が救い出される。これらの実験は、GGAAマイクロサテライトレポーター構築物の活性化、コロニー形成アッセイ、EWS/FLI活性化および-抑圧された遺伝子7、17、22の標的検証を含む、EWS IDDと重要な発癌表現型との間の構造機能関係をマッピングするための様々な欠失を有する構造に焦点を当てた。.しかし、これらの研究では、EWS/FLI の EWS IDD 内で、アクティブ化または抑制に対して一意に重要な個別のサブドメインを見つけることができませんでした。すべての試験された構築物は、特異的標的遺伝子を活性化および抑制し、効率的なコロニー形成を導くことができたか、またはEWS/FLI標的遺伝子のいずれかを調節することができず、コロニー形成7、17、22の喪失につながった。
次世代シーケンシングの普及によって可能になったトランスクリプトーム分析は、スクリーニングまたは記述的研究の文脈で頻繁に、2つの条件で遺伝子発現シグネチャを比較するために一般的に使用される。その代わりに、RNA-シーケンシング(RNA-seq)を用いてゲノム全体の発現データを捕捉し、IDDが転写因子機能に寄与することを特徴付ける機能を活用したいと考えていました。この場合、RNA-seq はノックダウン-レスキューシステムと組み合わされ、EWS ドメインの構造機能関係を調べます。このアプローチは、他のEWS融合や、十分に理解されていない機能を持つ野生型転写因子を含む他の融合転写因子に適用可能であり、レポーターアッセイや標的qRT-PCRなどの機能マッピング研究に使用される他のアッセイよりも複数の利点があります。これらには、関連クロマチンコンテキストにおける機能の構造的決定要因のテスト、1つのアッセイで複数のタイプの応答要素(すなわち、活性化および抑圧された、GGAA-マイクロサテライトおよび非マイクロサテライトなど)をテストする能力、および部分的な機能をより良く検出する能力が含まれる。
このアプローチの成功した実装は、対象となる表現型(この場合はshRNA媒介EWS/FLI枯渇を有するA673細胞)を捕捉する細胞系システムと、細胞系システムに適した発現ベクター中の変異構造のパネル(この場合、pMSCV-hygroと様々な3x FLAGタグ付きEWS/FLI変異体を有する様々な3x-FLAGタグ付きEWS/FLI変異体を有する)に依存する。CRISPRベースの枯渇構築物、shRNAベースの枯渇構築物、および安定した細胞株を生成するための適切な選択を伴うcDNA発現構築物のウイルス伝達は、一過性トランスフェクションよりも推奨される。結果の下流の解釈は、トランスクリプトームデータが、転写因子および他の表記の読み出しの局在化に関連する他のデータと組み合わせることができる場合に強化される。
本稿では、このアプローチを適用して、EWS/FLI14のDAF変異体の活性を特徴付けます。DAF変異体は、EWS/FLI14のEWS IDDの反復領域における17のチロシンからアラニン変異を有する。この特定のEWS変異体は以前に報告されており、ATF1 DBD14に融合するとレポーター遺伝子発現を活性化することができない。しかし、予備的なqRT-PCRデータは、この変異体がEWS/FLI標的 NR0B123の転写を活性化することができたことを示唆した。ここで説明したトランスクリプトームアプローチにより、DAF変異体の部分機能の検出に成功した。これらのトランスクリプトデータとEWS/FLI結合および認識モチーフに関する情報を組み合わせることで、DAF変異体がGGAAマイクロサテライトの繰り返しで機能を保持することをさらに示す。これらの結果は、DAFを最初の部分的に機能的なEWS/FLI変異体として同定し、非マイクロサテライト遺伝子のハイライト機能を、腫瘍発生にとって重要である(報告された23)。これは、発癌性転写因子の機能に関する洞察を提供するために、この転写構造関数マッピングアプローチの力を示す。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Wet Lab Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FLI rabbit pAb</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15289</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-lamin B1 rabbit pAb</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16048</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-based system for introduction of mutant constructs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Determined by cell system used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For viral aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>For viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>For viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10131027</td>
			<td>For viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293-EBNAs</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-10852</td>
			<td>For viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 anti-FLAG mouse mAb</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3165</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Near IR-secondary antibodies</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimem</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985062</td>
			<td>For viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin/Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td>For viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td>For viral transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8833</td>
			<td>Stored at 2 mg/mL stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74136</td>
			<td>Has gDNA removal columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selection reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>As dictated by cell system used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>For viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Determined by cell system used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-LT1</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>MIR 2304</td>
			<td>For viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Access to HPC environment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnnotationDbi</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.38.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cairo</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.5-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DESeq2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.16.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>genefilter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.58.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ggbiplot</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ggplot2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>org.Hs.eg.db</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pheatmap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.0.12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PuTTY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.4.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RColorBrewer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.1-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reshape2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rgl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.100.19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-studio</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Version 2.6 or later</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sva</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.24.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrimGalore!</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WinSCP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mapping the structure-function relationships of disordered oncogenic transcription factors using transcriptomic analysis

多くの癌は、発癌性融合転写因子の発現をもたらす染色体転座によって特徴付けられる。典型的には、これらのタンパク質は、別のタンパク質のDNA結合ドメイン(DBD)と融合した本質的に障害のあるドメイン(IDD)を含み、悪性腫瘍を促進するために広範囲にわたる転写変化を調整する。これらの融合は、多くの場合、それらが引き起こす癌における唯一の繰り返しゲノム収差であり、魅力的な治療標的となる。しかし、発がん性転写因子を標的化するには、その機能において複雑性の低いIDDが果たす機械学的役割をよりよく理解する必要があります。EWSR1 の N 末端ドメインは、EWS/FLI、EWS/ATF、および EWS/WT1 を含むさまざまな発癌性融合転写因子に関与する IDD です。ここでは、RNA-シーケンシングを用い、ユーイング肉腫におけるEWS/FLIの転写機能に重要なEWSドメインの構造的特徴を調べる。まず、種々のEWS変異体構築物の異所発現と組み合わせたユーイング肉腫細胞からの内因性融合のshRNA媒介型枯渇が行われる。次に、RNA-シーケンシングを使用して、これらの構築物を発現する細胞の転写体を分析し、EWSドメインの突然変異に関連する機能的欠陥を特徴付ける。トランスクリプトーム解析と、EWS/FLI DNA結合モチーフに関する以前に発表された情報、ゲノム局在化、および機能性転換のための機能アッセイを統合することで、発癌に重要なEWS/FLIの構造的特徴を特定し、ユーイング肉腫にとって重要なEWS/FLI標的遺伝子の新しいセットを定義することができました。本論文では、発癌性転写因子の本質的に乱れたドメインの構造機能関係をマッピングする方法としてRNA-シーケンシングを用いることを示す。

予備的なqRT-PCRデータは、DAFと呼ばれるEWS/FLI変異体が、EWSの反復および障害領域におけるアラニン突然変異に特異的なチロシンを有し、EWS/FLI標的遺伝子を活性化する能力を維持したが、重要な標的遺伝子23を抑制できなかったことを示唆した。EWS ドメインと EWS/FLI 関数におけるこれらの残留物の関係をより深く理解するために、上記で説明したプロトコルと 、図 1 で概説したプロトコルを使用しました。A673ユーイング肉腫細胞は 、FLI1の3'UTRを標的とするshRNAでウイルス的にトランスタイズされ、内因性EWS/FLIが枯渇した。4日間の選択の後、EWS/FLI機能は、異なる3XFLAGタグ付きEWS/ FLI変異体構造のウイルス伝達で救出され、救助のためのコントロールとして空のベクトルを備えた。EWSドメインを欠いた非機能的変異体(Δ22)を負のコントロールとして使用し、wtEFと呼ばれる野生型EWS/FLIを陽性対照として使用した(図2A)。DAF はテストコンストラクトとして使用されましたが、必要に応じて複数のテスト構成を使用できます。細胞をさらに10日間選択して、構築発現が安定化し、RNA(gDNA除去ステップを有する)、タンパク質およびコロニー形成アッセイについて収集した。4つの複製物を収集し、効果的なノックダウンとレスキューを示す代表的なqRT-PCRとウェスタンブロットを 図2B-Dに示します。DAF救出細胞は 図2Eに示すようにコロニーを形成できず、発癌性転換障害を示唆することに留意すべきである。
複製検証と表現型アッセイが完了した後、RNAは図書館の準備と次世代シーケンシングのために全国小児病院ゲノム医学研究所に提出され、約5,000万個の150-bpペアエンドリードを収集しました。データは fastq.gz ファイルとして返されました。低品質の読み取りはTrimGaloreでこれらのファイルからトリミングされ、STARは読み取りをヒトゲノムhg19に整列させ、遺伝子あたりの読み取りをカウントするために使用されました。hg19は、下流分析で使用されるEWS/FLI用の他のキュレーションデータセットとの互換性を目的として使用されました。これらの読み取りカウントは、すべてのサンプルの単一のカウント行列に結合され、最初の6行は 図3に示されています。
カウントは、最初はバッチ正規化なしでDESeq2を介して実行されたが、サンプルからサンプルまでの距離の目視検査は、 図4Aの赤い矢印で強調された図のように、潜在的な交位バッチ効果を示した。これは、培養中の細胞の通過によって導入された生物学的変動と、各バッチの処理の違いのために生じた可能性が高い。バッチ効果の正規化は、ComBat で行われ、一般的にお勧めします。バッチ正規化データのサンプルからサンプルまでの距離を 図 4Bに示します。バッチ正規化の後、DESeq2を使用して、ベースラインに対する3つの構成体(wtEF、Δ22、およびDAF)の転写プロファイルを生成した。「ペアレンタル」A673細胞(ここで「iLuc」と呼ばれる模擬ノックダウンと模擬救助)が含まれていたが、この実験の参照は、iEF細胞と呼ばれるEWS / FLIが枯渇した細胞である。iLucサンプルとiEFを比較することで、内因性タンパク質の転写プロファイルを生成することができ、これは救助システムの仕組みを理解することに興味があるかもしれませんが、それはこの特定の分析の目的ではありません。突然変異体に対して生成される転写プロファイルには、陽性(wtEF)および負(Δ22)コントロールが含まれ、iEFに関しては、これらは他の突然変異体のベンチマークとして機能すべきである。これは、この例の正のコントロールが他の7,23で説明されているように内因性 EWS/FLI の機能を完全に再現していなかったので、重要です。
図5の主成分分析(PCA)は、DAFの転写プロファイルがwtEFとΔ22の中間であることを示唆しており、部分機能を確認する。さらに、サンプル全体で最も多い1000個の可変遺伝子の階層クラスタリングは、図6Aおよび図S5に示すように、DAFがEWS/FLI標的遺伝子を抑制できず、部分的に遺伝子活性化活性を部分的に保持したことを示した。ToppGene分析は、DAFが活性化する遺伝子のクラスが、DAFが機能しないEWS/FLI活性化ターゲットと機能的に異なることを示唆した(図6B)。興味深いことに、wtEFによって救出された活性化遺伝子の機能は、DAFではなく、転写制御およびクロマチン調節に関連しているように見える。コロニー形成アッセイの結果に基づいて、このコア遺伝子シグネチャからの遺伝子は、EWS/FLI媒介性腫瘍発生におけるその役割についてさらに分析されるべきである。EWS/FLI媒介遺伝子抑制の重要性は、以前に17.
EWS/FLIはGGAAマイクロサテライトリピート要素19、22に対するユニークな結合親和性を有し、これらの要素での結合が下流遺伝子調節11、15、18、20、22を駆動することが知られている。これらのマイクロサテライトは、活性化または抑圧に関連付けられているかとして特徴付けられており、近位(<5 kb)TSSまたは位数(>5 kb)TSS25との間に近い。また、TSS23に近い近位に高親和性(HA)ETSモチーフを有するEWS/FLI調節遺伝子があります。DAF機能の特性や、DAFがどのような種類のEWS/FLI活性化遺伝子を救い出すことができたかをさらに分析するために、これらの異なるクラスに関連する遺伝子の微分発現を分析した。興味深いことに、DAFはGGAAマイクロサテライト活性化遺伝子を最も救出することができたが、図7に示すようにHAサイトの近くで活性化された遺伝子を救出することができなかった。階層クラスタリングに見られるように、DAF は、モチーフ クラス間で EWS/FLI 媒介の抑圧を救い出しません。これらのデータは、DAFがGGAAマイクロサテライトに結合し、TSSに近位および遠位の両方で活性化するのに十分なEWSの構造的特徴を保持していることを示唆している。これは、GGAA の EWS/FLI アクティビティで重要であると考えられている無傷の SYGQ ドメインが11を繰り返し行うことから生じる可能性があります。これらのデータはまた、DAFで変異した特定のチロシンが、HAサイトからのEWS/FLI媒介性遺伝子調節における重要な役割を果たすが、十分に理解されておらず、遺伝子抑制において、さらなる調査の重要な領域を強調することを示唆している。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61564/61564fig01.jpg"> 図1:ワークフロー。転写法による構造関数マッピングを行うステップバイステップの手順の描写。細胞は、構造関数マッピングに必要な一連の構成体を表すために最初に用意された。次の発現に続いて、細胞をRNAおよびタンパク質について採取し、相関表現型についてアッセイした。構築物の発現を検証し、このプロセスを3〜4回繰り返して独立した生物学的複製物を収集した。RNAは次世代シーケンシング(NGS)のために提出されました。データを受信すると、データの品質が調整され、位置合わせされ、トランスクリプトあたりの数が計算されました。バッチ効果を、転写シグネチャおよび微分発現について制御し、DESeq2を用いて決定した。他の-omicsデータセットと異なる経路または機能解析を統合した階層クラスタリングとダウンストリーム解析を組み込むことができます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61564/61564fig02.jpg"> 図2:構築式および相関アッセイの検証(A) この例でテストされた構成を示す回路図。(B) 免疫ブロットによる内因性EWS/FLIのノックダウンと3X FLAGタグ付きコンストラクトの発現の検証(C,D)EWS/FLI(C)活性化標的遺伝子における構築活性の検証、NR0B1、および(D)は、qRT-PCRによる標的遺伝子TGFBR2を抑圧した。データは平均 +/- 標準偏差として表示されます。P値は、Tukeyの正直な有意性検定で計算された。* p < 0.05, ** p < 0.01, ***p < 0.005 (E) コロニーは、構成体の変換活性を評価するために行われるソフト寒天アッセイからカウントします。P値は、Tukeyの正直な有意性検定で計算された。* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.005.この図は、Theisen、他の23から適応され、<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564fig02large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61564/61564fig03.jpg"> 図 3: 分析用の最終的な照合されたカウント データ。バッチ正規化および分析されるすべてのサンプルの遺伝子数を含むカウントファイルの最初の6行のスクリーンショット。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61564/61564fig04v3.jpg"> 図 4: サンプルからサンプルまでの距離ヒートマップ(A) 生のカウント データのサンプル クラスタリングを示すサンプルからサンプルまでの距離プロット。バッチとサンプルの両方でクラスタリングしているサンプルは赤い矢印で示されます。(B)ComBat でのバッチ正規化後のサンプルからサンプルまでの距離プロット。ここでは、すべてのサンプルがバッチから独立してクラスターをまとめて複製します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61564/61564fig05.jpg"> 図5:微分式解析の結果(A)全サンプルに対して生成されたトランスクリプトームシグネチャの原理成分分析(PCA)プロットは、強力なサンプル内クラスタリングを示し、DAFが正(wtEF)と負(Δ22)コントロールの間で中間であることを実証する。(B) 各コンストラクトの遺伝子について、log2FoldChange に対してプロットされた -log(p-value) を示す火山プロット。調整されたp値<0.05および|log2(FoldChange)|> 1 は重要と見なされ、赤で示されます。パネル5Bは、Theisenから適応され、他の23<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61564/61564fig06.jpg"> 図 6: 遺伝子クラスを識別するための階層クラスタリング(A) 全ての構成体およびベースラインであるiEFにおける上位1000個の最も可変的な遺伝子の階層的クラスタリングは、DAFがEWS/FLI媒介遺伝子活性化を部分的に救い出す。(B) 遺伝子オントロジー(分子機能)は、DAFによって救出されるか、または救出されないEWS/FLI活性化遺伝子の機能的エンリッチメントを示すToppGeneから生じる。パネル6Bは、Theisenから適応され、他の23<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564fig06large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61564/61564fig07.jpg"> 図 7: 異なる構成体に対する異なる転写因子応答要素の詳細な分析: (A)パネルの生成に使用されるデータ処理を示す回路図 (B) と (C) トランスクリプトーム プロファイルを持つ他の利用可能なデータセットを組み込むことによって、(B,C)直接EWS/FLI- (B) がアクティブ化され、(C) がターゲットを抑圧されたさまざまなクラスのレスキューを示すコンパイル。含まれる遺伝子は、内因性EWS/FLIによる検出可能な微分発現を有する遺伝子のみであった。各円グラフでは、構成体によって救出されない遺伝子の部分を灰色で示しています。赤は遺伝子の中で、微分活性を示し、青色は、遺伝子の一部を示し、その部分は、微分抑圧されている。この図は、Theisen、他の23から適応され、<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564fig07large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
図 S1: HPC 環境への fastq.gz ファイルのロード、トリミング、および配置<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564supfig01.jpg" target="_blank">こちらをクリックして、この図をダウンロードしてください。</a>
図 S2: サンプル全体で読み取り数を照合し、ComBat でバッチ正規化を実行します。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564supfig02.jpg" target="_blank">こちらをクリックして、この図をダウンロードしてください。</a>
図S3:DESeq2の実行と微分式解析の結果の抽出<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564supfig03.jpg" target="_blank">こちらをクリックして、この図をダウンロードしてください。</a>
図 S4: 出力の分析<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564supfig04.jpg" target="_blank">こちらをクリックして、この図をダウンロードしてください。</a>
図 S5: 遺伝子クラスを識別するための階層クラスタリング: すべての構成体とベースライン iEF の上位 1000 個の可変遺伝子の階層的クラスタリングは 、k クラスターに分類されます。この例では k=7 ですが、このパラメータは 図 S4Dに示すようにユーザーによって設定されます。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564supfig05.jpg" target="_blank">こちらをクリックして、この図をダウンロードしてください。</a>
表S1:クラスターアノテーションを有する遺伝子(Ensembl遺伝子ID)のリスト。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61564/Table_S1.xlsx" target="_blank">こちらの表をダウンロードしてください。</a>

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Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

本質的に障害が発生したドメインは、発癌性融合転写因子機能にとって重要である。これらのタンパク質を治療的に標的にするためには、これらのドメインで採用される調節機構のより詳細な理解が必要である。ここでは、Ewing肉腫における本質的に無秩序なEWSドメインの重要な構造的特徴をマッピングするために、トランスクリプトミクスを使用する。

トランスクリプトーム解析を用いた無秩序発がん性転写因子の構造機能関係のマッピング

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

2.6K ビュー.  Abigail Wexner Research Institute at Nationwide Children's Hospital. 本質的に障害が発生したドメインは、発癌性融合転写因子機能にとって重要である。これらのタンパク質を治療的に標的にするためには、これらのドメインで採用される調節機構のより詳細な理解が必要である。ここでは、Ewing肉腫における本質的に無秩序なEWSドメインの重要な構造的特徴をマッピングするために、トランスクリプトミクスを使用する。...

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Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Metastatic cancer accounts for 90% of deaths in patients with solid tumors. There is an urgent need to better understand the drivers of cancer metastasis and to identify novel therapeutic targets. To investigate molecular events that drive the progression from primary cancer to metastasis, we have developed a bitransgenic mouse model, RIP-Tag; RIP-tva. In this mouse model, the rat insulin promoter (RIP) drives the expression of the SV40 T antigen (Tag) and the receptor for subgroup A avian leukosis virus (tva) in pancreatic &#946; cells. The mice develop pancreatic neuroendocrine tumors with 100% penetrance through well-defined stages that are similar to human tumorigenesis, with stages including hyperplasia, angiogenesis, adenoma, and invasive carcinoma. Because RIP-Tag; RIP-tva mice do not develop metastatic disease, genetic alterations that promote metastasis can be identified easily. Somatic gene transfer into tva-expressing, proliferating pancreatic &#946; premalignant lesions is achieved through intracardiac injection of avian retroviruses harboring the desired genetic alteration. A titer of &#62;1 x 108 infectious units per ml is considered appropriate for in vivo infection. In addition, avian retroviruses can infect cell lines derived from tumors in RIP-Tag; RIP-tva mice with high efficiency. The cell lines can also be used to characterize the metastatic factors. Here we demonstrate how to utilize this mouse model and cell lines to assess the functions of candidate genes in tumor metastasis.

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

We present a protocol to demonstrate a novel somatic gene transfer system utilizing RIP-Tag; RIP-tva mouse model to study the function of genes in metastasis. The avian retroviruses are delivered intracardiacally to ensure gene transfer into pre-malignant, noninvasive lesions of pancreatic &#946; cells in adult mice.

同定と新規リップ-タグ; に遺伝子導入による転移因子の解析RIP tvaマウスモデル

Metastatic cancer accounts for 90% of deaths in patients with solid tumors. There is an urgent need to better understand the drivers of cancer metastasis ...

がん研究

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to generate RNA-guided nucleases, such as CRISPR-associated (Cas) 9 for site-specific eukaryotic genome editing. Genome engineering by Cas9 is used to efficiently, easily and robustly modify endogenous genes in many biomedically-relevant mammalian cell lines and organisms. Here we show an example of how to utilize the CRISPR/Cas9 methodology to understand the biological function of specific genetic mutations. We model calreticulin (CALR) mutations in murine interleukin-3 (mIL-3) dependent pro-B (Ba/F3) cells by delivery of single guide RNAs (sgRNAs) targeting the endogenous Calr locus in the specific region where insertion and/or deletion (indel) CALR mutations occur in patients with myeloproliferative neoplasms (MPN), a type of blood cancer. The sgRNAs create double strand breaks (DSBs) in the targeted region that are repaired by non-homologous end joining (NHEJ) to give indels of various sizes. We then employ the standard Ba/F3 cellular transformation assay to understand the effect of physiological level expression of Calr mutations on hematopoietic cellular transformation. This approach can be applied to other genes to study their biological function in various mammalian cell lines.

Targeted gene editing using CRISPR/Cas9 has greatly facilitated the understanding of the biological functions of genes. Here, we utilize the CRISPR/Cas9 methodology to model calreticulin mutations in cytokine-dependent hematopoietic cells in order to study their oncogenic activity.

CRISPR/Cas9 を使用して遺伝子変異カルレティキュリン サイトカイン依存性造血細胞での発癌性の活動を調査する編集

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. In the clinical setting, formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues are widely used for genetic testing. However, FFPE DNA is generally damaged and fragmented during the fixation process with formalin. Therefore, FFPE DNA is sometimes not adequate for genetic testing because of low quality and quantity of DNA. Here we present a method of touch imprint cytology (TIC) to obtain genomic DNA from cancer cells, which can be observed under a microscope. Cell morphology and cancer cell numbers can be evaluated using TIC specimens. Furthermore, the extraction of genomic DNA from TIC samples can be completed within two days. The total amount and quality of TIC DNA obtained using this method was higher than that of FFPE DNA. This rapid and simple method allows researchers to obtain high-quality DNA for genetic testing (e.g., next generation sequencing analysis, digital PCR, and quantitative real time PCR) and to shorten the turnaround time for reporting results.

Obtaining high-quality genomic DNA from tumor tissues is an essential first step for analyzing genetic alterations using next generation sequencing. In this article, we present a simple and rapid method to enrich tumor cells and obtain intact DNA from touch imprint cytology specimens.

タッチ捺印細胞診を用いた臨床病理標本から質の高い腫瘍 DNA を取得する簡易法

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of associated loci. In addition, the presence of specific modifications has been used to determine the position and identity non-coding functional elements such as enhancers. In recent years, chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) has become a powerful tool in determining the genome-wide profiles of individual histone modifications. However, it has become increasingly clear that the combinatorial patterns of chromatin modifications, referred to as Chromatin States, determine the identity and nature of the associated genomic locus. Therefore, workflows consisting of robust high-throughput (HT) methodologies for profiling a number of histone modification marks, as well as computational analyses pipelines capable of handling myriads of ChIP-Seq profiling datasets, are needed for comprehensive determination of epigenomic states in large number of samples. The HT-ChIP-Seq workflow presented here consists of two modules: 1) an experimental protocol for profiling several histone modifications from small amounts of tumor samples and cell lines in a 96-well format; and 2) a computational data analysis pipeline that combines existing tools to compute both individual mark occupancy and combinatorial chromatin state patterns. Together, these two modules facilitate easy processing of hundreds of ChIP-Seq samples in a fast and efficient manner. The workflow presented here is used to derive chromatin state patterns from 6 histone mark profiles in melanoma tumors and cell lines. Overall, we present a comprehensive ChIP-seq workflow that can be applied to dozens of human tumor samples and cancer cell lines to determine epigenomic aberrations in various malignancies.

Here, we describe an optimized high-throughput ChIP-sequencing protocol and computational analyses pipeline for the determination of genome-wide chromatin state patterns from frozen tumor tissues and cell lines.

腫瘍組織に高スループット チップ シーケンスを用いたクロマチン状態のゲノム マッピングの統合プラットフォーム

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of ...

An Oncogenic Hepatocyte-Induced Orthotopic Mouse Model of Hepatocellular Cancer Arising in the Setting of Hepatic Inflammation and Fibrosis

The absence of a clinically relevant animal model addressing the typical immune characteristics of hepatocellular cancer (HCC) has significantly impeded elucidation of the underlying mechanisms and development of innovative immunotherapeutic strategies. To develop an ideal animal model recapitulating human HCC, immunocompetent male C57BL/6J mice first receive a carbon tetrachloride (CCl4) injection to induce liver fibrosis, then receive histologically-normal oncogenic hepatocytes from young male SV40 T antigen (TAg)-transgenic mice (MTD2) by intra-splenic (ISPL) inoculation. Androgen generated in recipient male mice at puberty initiates TAg expression under control of a liver-specific promoter. As a result, the transferred hepatocytes become cancer cells and form tumor masses in the setting of liver fibrosis/cirrhosis. This novel model mimics human HCC initiation and progression in the context of liver fibrosis/cirrhosis and reflects the most typical features of human HCC including immune dysfunction.

Here, we describe the development of a clinically relevant murine model of liver cancer recapitulating the typical immune features of hepatocellular cancer (HCC).

肝炎症と線維症の設定に起因する肝細胞癌の腫瘍性肝細胞誘発性オルコトピックマウスモデル

The absence of a clinically relevant animal model addressing the typical immune characteristics of hepatocellular cancer (HCC) has significantly impeded ...

Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples from cancer patients often directly influences diagnosis, prognosis, and/or therapy selection. As a result, the accurate detection of gene fusions has become a critical component of clinical management for many disease types. Until recently, clinical gene fusion detection was predominantly accomplished through the use of single-gene assays. However, the ever-growing list of gene fusions with clinical significance has created a need for assessing fusion status of multiple genes simultaneously. Next generation sequencing (NGS)-based testing has met this demand through the ability to sequence nucleic acid in massively parallel fashion. Multiple NGS-based approaches that employ different strategies for gene target enrichment are now available for use in clinical molecular diagnostics, each with its own strengths and weaknesses. This article describes the use of anchored multiplex PCR (AMP)-based target enrichment and library preparation followed by NGS to assess for gene fusions in clinical solid tumor specimens. AMP is unique among amplicon-based enrichment approaches in that it identifies gene fusions regardless of the identity of the fusion partner. Detailed here are both the wet-bench and data analysis steps that ensure accurate gene fusion detection from clinical samples.

This article details the use of an anchored multiplex polymerase chain reaction-based library preparation kit followed by next-generation sequencing to assess for oncogenic gene fusions in clinical solid tumor samples. Both wet-bench and data analysis steps are described.

アンカー多重ポリメラーゼ連鎖反応を用いた腫瘍性遺伝子融合検出、次世代シーケンシング

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples ...

Analyzing Tumor Gene Expression Factors with the CorExplorer Web Portal

Differential gene expression analysis is an important technique for understanding disease states. The machine learning algorithm CorEx has shown utility in analyzing differential expression of groups of genes in tumor RNA-seq in a way that may be helpful for advancing precision oncology. However, CorEx produces many factors that can be challenging to analyze and connect to existing understanding. To facilitate such connections, we have built a website, CorExplorer, that allows users to interactively explore the data and answer common questions related to its analysis. We trained CorEx on RNA-seq gene expression data for four tumor types: ovarian, lung, melanoma, and colorectal. We then incorporated corresponding survival, protein-protein interactions, Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichments, and heatmaps into the website for association with the factor graph visualization. Here we employ example protocols to illustrate use of the database for comprehending the significance of the learned tumor factors in the context of this external data.

We introduce the CorExplorer web portal, an resource for exploration of tumor RNA sequencing factors found by the machine learning algorithm CorEx (Correlation Explanation), and show how factors can be analyzed relative to survival, database annotations, protein-protein interactions, and one another to gain insight into tumor biology and therapeutic interventions.

CorExplorer Web ポータルを用した腫瘍遺伝子発現因子の解析

Differential gene expression analysis is an important technique for understanding disease states. The machine learning algorithm CorEx has shown utility ...

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for anti-cancer therapies. However, directly targeting transcription factors is often difficult and can cause adverse side effects if the transcription factor is necessary in one or more adult tissues. Identifying upstream regulators that aberrantly activate transcription factors in cancer cells offers a more feasible alternative, particularly if these proteins are easy to drug. Here, we describe a protocol that can be used to combine arrayed medium-scale lentiviral libraries and a dual-luciferase-based transcriptional reporter assay to identify novel regulators of transcription factors in cancer cells. Our approach offers a quick, easy, and inexpensive way to test hundreds of genes in a single experiment. To demonstrate the use of this approach, we performed a screen of an arrayed lentiviral RNAi library containing several regulators of Yes-associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with PDZ-binding motif (TAZ), two transcriptional co-activators that are the downstream effectors of the Hippo pathway. However, this approach could be modified to screen for regulators of virtually any transcription factor or co-factor and could also be used to screen CRISPR/CAS9, cDNA, or ORF libraries.

To identify novel regulators of transcription factors, we developed an approach to screen arrayed lentiviral or retroviral RNAi libraries using a dual-luciferase-based transcriptional reporter assay. This approach offers a quick and relatively inexpensive way to screen hundreds of candidates in a single experiment.

アレイ化されたライブラリの中スループットスクリーニングとデュアルルシファーゼベースレポーターを用いた転写因子レギュレータの同定

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using supernatants from Lactobacillus fermentum cell culture, considered as probiotics cultures. The use of 3D cultures to test Lactobacillus cell-free supernatant (LCFS) are a better option than testing in 2D monolayers, especially as L. fermentum can produce anti-cancer effects within the gut. L. fermentum supernatant was identified to possess increased anti-proliferative effects against several colorectal cancer (CRC) cells in 3D culture conditions. Interestingly, these effects were strongly related to the culture model, demonstrating the notable ability of L. fermentum to induce cancer cell death. Stable spheroids were generated from diverse CRCs (colorectal cancer cells) using the protocol presented below. This protocol of generating 3D spheroid is time saving and cost effective. This system was developed to easily investigate the anti-cancer effects of LCFS in multiple types of CRC spheroids. As expected, CRC spheroids treated with LCFS strongly induced cell death during the experiment and expressed specific apoptosis molecular markers as analyzed by qRT-PCR, western blotting, and FACS analysis. Therefore, this method is valuable for exploring cell viability and evaluating the efficacy of anti-cancer drugs.

Here methods are presented to understand anti-cancer effects of Lactobacillus cell-free supernatant (LCFS). Colorectal cancer cell lines show cell deaths when treated with LCFS in 3D cultures. The process of generating spheroids can be optimized depending on the scaffold and the analysis methods presented are useful for evaluating the involved signaling pathways.

大腸癌細胞の3次元スフェロイド培養におけるプロバイオティクスの細胞遊離上清を用いた細胞死の評価

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides (MF) and S&#233;zary syndrome (SS) represent the most common subtypes. Despite a number of studies on characterizing gene expression, genetic alterations, and epigenetic abnormalities of CTCL, the molecular pathogenesis of MF/SS remains unclear. MF refers to the more common CTCL with a skin-predominance, and is usually limited to skin, whereas&#160;SS is an aggressive leukemic variant of CTCL with widespread skin involvement and is characterized by neoplastic distribution mainly involving blood, skin, and lymph node. Focusing on clinical practice, the identification of gene expression biomarkers has&#160;enormous potential to improve diagnosis and treatment of MF/SS. Indeed, recent transcriptomic studies have identified potential diagnostic biomarkers from differences in gene expression between normal and malignant T cells, which may improve our understanding of SS biology, and reveal potential therapeutic targets. This manuscript describes a detailed reproducible protocol for the isolation of peripheral blood mononuclear cells from fresh whole blood from patients diagnosed with SS, selection of CD4+ memory T cells (CD4+CD45RO+ T cells), chemical stimulation, and preparation of RNA suitable for transcriptomic profiling to discover novel prognostic molecular markers to gain additional insight in disease etiology. The stimulation using chemical agonist to activate nuclear regulation provides more specific assessment for pathways important in the dynamic transcription regulation and gene expression and eliminates confounding defects that may arise from upstream signaling defects arising from TCR antigen loss at the cell membrane. The data obtained from comparison of transcriptome of unstimulated to stimulated SS T cells unmasks functional regulatory gene expression defects not evident from analysis of quiescent unstimulated cells. Furthermore, the method outlined from this approach can be adapted for studying T cell gene expression defects in other T cell immune diseases.

We present a simple protocol for the isolation of peripheral blood mononuclear cells from whole blood obtained from patients diagnosed with S&#233;zary Syndrome, followed by selection of CD4+ T cells, their stimulation with phorbol12-myristate13-acetate and A23187 ionophore, and preparation of RNA for transcriptomic profiling.

トランスクリプトームプロファイリングのためのセザリー症候群患者からのヒト末梢血単核球およびCD4+ T細胞の単離

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...