DNA上の転写因子の相分離を観察するための単一分子アッセイを提供します この技術により、転写因子がDNA上に液滴として集合する動的なプロセスをリアルタイムで実現できます。EWS-FL1は、ユーイング肉腫腫瘍形成において最も頻繁に関与する融合遺伝子の1つです。私たちの研究は、DNAモチーフ数と、腫瘍細胞における不毛な遺伝子転写に関連するEWS-FL1凝縮物形成との関係を特定し、予後に役立つ可能性があります。
この方法は、P53やMED1などの転写縮合物または複合体をin vitroで研究するために適用できます。DNAカーテン実験用のジグザグナノ加工バリアを備えたフローセルを調製するには、入力チューブと出力チューブを正しい方向に接続します。次に、2つの3ミリリットルのシリンジを使用して2.5ミリリットルの脂質バッファーでフローセルを洗浄し、フローセルに気泡がないことを確認します。
シリンジを出力から取り出し、各注射の間に5分間のインキュベーションを行いながら、1ミリリットルのリポソーム溶液を3回注入する。治癒のために、フローセルを2.5ミリリットルの脂質バッファーでゆっくりと再洗浄し、室温で30分間インキュベートします。インキュベーション中に、テキスト原稿に記載されているようにBSAバッファーを調製します。
次に、30分間の治癒後、フローセルを出力側から2.5ミリリットルのBSAバッファーで洗浄します。次に、800マイクロリットルのストレプトアビジンバッファーを入力側からフローセルに2段階で注入し、各ステップの後に10分間インキュベートします。次に、フローセルを2.5ミリリットルのBSAバッファーで洗浄して、遊離ストレプトアビジン分子をすべて除去します。
次に、ビオチンラムダDNAをBSAバッファーを用いてクローニングモチーフで希釈し、5分間隔で4回ゆっくりと注入します。注入中に、科学的な相補金属酸化物半導体システムの顕微鏡の電源を入れます。次に、チューブを10ミリリットルの二重蒸留水で洗浄し、プリズムとチューブコネクタを水、2%液体キュベットクリーナー、および99%エタノールですすいでください。
次に、少なくとも20ミリリットルのイメージングバッファーを30ミリリットルのシリンジに引き込みます。顕微鏡ステージにフローセルを設置し、マイクロ流体システムに接続します。毎分0.03ミリリットルの流速を使用して、DNA分子をバリアに10分間洗い流します。
次に、マイクロ流体システムのスイッチを切り、30分間インキュベートします。流れが止まり、DNAが横方向に拡散します。DNAカーテン上でEWS-FLI1凝縮形成を画像化するには、イメージングソフトウェアを開き、明視野下で9つのジグザグパターンの位置を見つけてマークします。
次に、毎分0.2ミリリットルでフローをオンにして、二本鎖DNA色素でDNAを10分間染色します。次に、mCherry EWS-FLI1タンパク質をイメージングバッファーで100マイクロリットル中100ナノモルの濃度で希釈します。次に、タンパク質サンプルを100マイクロリットルのガラスシリンジでバルブに通し、流量を毎分0.4ミリリットルに変更します。
488ナノメートルのレーザーをオンにした後、各領域を事前にスキャンしてDNA分布状態を確認し、DNA分子が均等に分布する領域を選択します。次に、レーザー出力を10ナノメートルレーザーの場合は488%、20ナノメートルレーザーの場合は561%に設定します。そして、パワーメーターを使用して、プリズムの近くで実際のレーザーパワーを測定します。
488ナノメートルレーザーと561ナノメートルレーザーの両方で2秒間隔で画像の取得を開始します。次に、バルブを手動モードから注入モードに変更して、イメージングバッファーが60秒後にタンパク質サンプルをフローセルにフラッシュできるようにします。遊離したEWS-FLI1を除去するには、561ナノメートルのレーザーのみをオンにして、フローセルをイメージングバッファーで5分間洗浄し続けます。
その後、流れを止め、摂氏37度で10分間インキュベートします。10分後、毎分0.4ミリリットルでフローをオンにして、DNAを伸長させ、異なるフレーム間で2秒間隔で画像を取得して、EWS-FLI1凝縮物形成のハイスループットデータを取得します。EWS-FLI1分子は、561ナノメートルレーザーで得られたmCherry標識EWS-FLI1シグナルを検出することにより可視化した。
DNA基質中の25 GGAAリピートの部位におけるEWS-FLI1凝縮物のin vitro形成を直接可視化することができた。DNAカーテンに使用されたmCherry EWS-FLI1の特異性は、25 GGAAリピートを別々に含む場合と使用しない場合のDNAテンプレートを使用した電気泳動移動度シフトアッセイによって確認されました。EWS-FLI1濃度を20ナノモルから500ナノモルに滴定すると、EWS-FLI1強度は劇的に増加しました。
一方、タンパク質がGGAAリピートをカバーするように飽和している場合、FLI 1 DBD強度の変化はごくわずかであり、EWS-FLI1がDNA上に凝縮物を形成したことが示唆されました。リポソームとDNAがフローセル上に均等に分布できるように、注射は非常に遅くて柔らかくなければなりません。MSAを実行して、精製された転写因子がin vitroで標的配列と特異的に結合することを確認することが重要です。
この手法により、凝縮物が転写因子の標的検索を容易にするかどうか、およびその転写への影響を調べることができます。
