生体小角X線散乱は、高分子および高分子錯体の構造測定を提供する。理想的には、測定するサンプルは単分散する必要があります。場合によっては、サイズ排除クロマトグラフィーSAXSは単分散性を生成するのに十分ではありませんが、ソフトウェアベースのSAXSデータのデコンボリューションを行い、理想化されたSAXS曲線を生成することができます。
[名前を付けて保存] ボックスにサンプル名を入力し、[トレース] をクリックします。[詳細の編集] ボタンをクリックして、実験の詳細を編集し、適切なフィールドに入力します。バッファー フレームを手動で選択するには、[バッファーの設定] をクリックします。
左クリックしてドラッグして、約 100 フレームのサイズ除外クロマトグラフィー列のボイドボリュームの前に、トレースカーブ上のフラットとしてバッファを選択し直し、バッファを設定して更新して SEC ファイルを再計算します。左クリックして、信号プロット上の対象領域を選択し、ヒートマッププロットの十字線を左クリックしてドラッグして、マージに使用するフレームのズームとサブセットを選択します。もう 1 つの左クリックで、十字の右下の領域に対応するヒート マップのフレームをハイライト表示します。
理想的には、フレームは主にシアン色と安定したジャイロ半径を持つ領域を強調する必要があります。選択したフレームに問題がなければ、[マージ]をクリックして減算されたフレームをマージし、[解析]タブをクリックしてデータを表示します。データのデコンボリューションの場合は、データセットをデコンボリューション プログラムに読み込みます。
コントロールパネルのファイルで、フォルダシンボルを使用してデータを検索し、すべてのDATファイルをハイライト表示します。一連のプロットには、統合強度とフレーム番号のプロットが描画されます。系列タブで、クリックして曲線をハイライト表示し、LC 解析ポップアップウィンドウを開きます。
適切なバッファー領域を選択するには、[領域を追加] をクリックしてクロマトグラムのピークの前の領域と、溶媒の前面の後の領域を選択し、バッファーをクリックします。ポップアップ ウィンドウには、背景にフレームが選択されていない旨が表示されます。EFAを起動するには、ハイライト表示されたファイルを右クリックし、メニューからEFAを選択します。
ポップアップ ウィンドウで、データセットの単一値分解を観察する必要があります。コントロール ボックスで、[フレーム ボックスを使用]の値をオンにして、デコンボルテージするピーク領域全体が強度プロットで覆われていることを確認します。単数値プロットは、ベースラインの上の単数形値の強度を示します。
左と右の単一ベクトルが一致しない場合は、有意な単数ベクトル数を 2 に変更し、左右の単一ベクトルが類似するまでフレームを移動します。EFAは計算され、各ベクトルの前方および後方方向のプロットを生成し、選択されたサイズ除外クロマトグラフィーSAXSデータの解析プロファイルをいつ開始および終了するかを示す。RAW は範囲の識別を試みます。
必要に応じて、矢印を使用して範囲を変更し、各円が変曲点の始まりになるように、ベースラインから立ち上がったり、ベースラインに落ちたりして、[次へ]をクリックします。スパイクを減らすか、または除去するには、範囲制御矢印を使用して、スパイクに対応するフレームをほぼ特定し、コンポーネント範囲コントロールを調整します。最小カイ四角形が達成されたら、[戻る] をクリックして検証チェックを実行します。
元の EFA プロットが有効な場合は、[次へ]をクリックして EFA データを保存してプロットを保存します。次に[完了]をクリックしてEFAウィンドウを閉じます。次に、RAW ウィンドウで、プロット パネルでプロファイルを開いてカーブを表示します。
コントロール パネルの [プロファイル] タブで、右クリックしてカーブを DAT ファイルとして保存します。SAXS の決定では、散布図分析タブを開き、G を選択して、マニュアル Guinier 分析ツールを選択します。プロットで、残差に笑顔や眉をひそめたフィーチャーがないようにポイントを追加または削除します。
ギニエフィットで選択したデータは、最大キューに 1.3 の旋回限界の半径を掛けた値を超えないようにする必要があります。正規化されたクラツキーをクリックします。結果のプロットは、高分子、球状、円筒形、無秩序、質量、および濃度の構造状態の評価を提供する。
クリックして、相関のボリューム。Q プロットの関数としての総散乱強度と総散乱強度の積分領域は、散乱曲線の品質を検証するためのクイックリファレンスとして表示されます。柔軟性分析を開始するには、[柔軟性] をクリックします。
ポップアップウィンドウの各パネルは、コンパクトと細長い柔軟なバイオポリマーの間に存在する電力法関係を利用するプロットを示します。ボックスの下部にあるスライダを使用して、いずれかの区画の高原に到達するまでデータの表示を変更します。柔軟性分析を実行した直後に、ボリュームをクリックします。
3つのグラフのポップアップが生成されます。Porod-Debye プロットは、柔軟性プロットのスライダーが残された場所を追跡し、高原領域データを示します。パーティクルの体積を計算するには、プロット上の青い線が高原領域に合うように始点と終点を移動します。
公平な結果では、ポロド-デバイ指数の指数法適合の残差はパターンを示さないはずです。[R]タブのPでは、実際の空間分布とサンプルの散乱曲線が観察されます。理想的には、分布曲線は波のない滑らかで、x軸に優しく触れる必要があります。
サンプル名を右クリックし、[DMAX を検索]をクリックして新しいウィンドウを開きます。最大ディメンションの制限は、提案された最大 Q 範囲、計算に使用する最大データポイント、下限と上限の最大次元制限、および下方と上限のアルファ スコアで事前設定されます。[開始] をクリックします。
複合分布が、推奨される最大次元およびアルファレベルとともに作成されます。これらのデータが許容可能な場合は、ウィンドウを閉じて[R]タブのPに戻り、そこで、希望する最大Q範囲に合わせて相互空間プロットがトリミングされるようになりました。さらにモデルを選択し、[背景] をクリックして、ポップアップ ボックスの推奨値にアルファ レベルと最大ディメンションを設定します。
[絞り込み] をクリックします。クロス検証プロットが開き、赤で示された点が拒否されたかどうかが表示されます。拒否されたポイントが少なく、分布が良好に見える場合は、モデルが良好です。
[分析] タブでレポートを印刷します。左クリックしてサンプルをハイライトし、サンプル名を右クリックします。単一のデータセットから [レポートの作成] を選択します。
コメントを許可するテキストボックスが開き、生成されたすべての図と値を示すPDF文書が作成されます。本代表分析では、E9DNAポリメラーゼエキソヌクレアーゼマイナス変異体をDNAに結合し、サイズ排除クロマトグラフィー小角X線散乱を用いて実行した。2つのピークが観察された。
第1の大きなピークは、E9DNAポリメラーゼエキソヌクレアーゼから変異型DNA複合体を示す。2 つ目は非バインド状態を示します。フレームを選択する古典的なアプローチは、第1のピークで複合体の旋回の安定した半径を提供するが、第2のピークは明確にマージされ、プロット全体の旋回の半径は、対象の第2のピークは、クロスピーク汚染によるジャイロの安定した半径を持っていないことを示しています。
この解析では、半安定な旋回半径を示すフレームは5フレームしか使用できませんでした。減算すると、36.3オングストロームの旋回半径を与えた。ピークがEFAを用いてデコンボルテージされたとき、第2のピークに対応する曲線は元のピークと重ね合わされ、34.1オングストロームのノイズと低い旋回半径に対する信号の明確な減少を示した。
データのクラッキープロットは、畳み込んだピークを持つ複合体が、デコンボルト曲線の最大次元108.5オングストロームを与えるPR曲線によって確認されるように、より球状であることを明らかにします。この分析のための非デコンボルトデータは、最大次元120オングストロームでより細長く、最も可能性の高い非結合E9ポリメラーゼからエキソヌクレアーゼ変異体を差し引いた不均一性に起因する。最も重要なステップは、単数形の値と、これらのデータの範囲を選択する際に、デコンボリューションの精度に大きく影響を与えます。
結果は単独で取るべきではありませんが、分析遠心や多角レーザー光散乱などの追加技術を使用して生物学的解釈を可能にする追加の技術を使用してさらに評価する必要があります。In-line 列結合 SAXS とデコンボリューションと、Scatter が提供するプログラムのようなユーザーフレンドリーなインターフェイスは、本質的に困難なシステムからも意味のある構造データを提供する強力なパッケージです。
