以下のプロトコルは、中間散乱機能を測定し、溶液中のタンパク質のダイナミクスを調査するために中性子スピンエコー実験を設定する方法を提示する。中性子スピンエコー分光法の主な利点は、タンパク質ドメインとサブドメインの再配列をピコからナノ秒の時間スケールで見ることができることです。中性子スピンエコーは同位体配置にも敏感で、コントラストマッチングを使用した非常に特異的でターゲットを絞った研究が可能です。
タンパク質ドメインダイナミクスへの洞察は、タンパク質のドメイン運動を生物学的機能と中継するという進行中の困難な作業における生物物理学的研究の主要な部分である。ここで紹介するプロトコルは、ソフトマター材料の領域内にとどまれば、サンプルの選択に関係なく、SNS-NSE分光計で実行される中性子スピンエコー測定に一般的に適用できます。実験を設定するには、タンパク質サンプルの濃度、測定に必要な温度、および利用可能な溶液の量に基づいて、細胞サンプルの負荷の厚さを選択することから始めます。
リン酸塩フリーの食器用洗剤、イオン交換水、および70%のジエタノールでセルを洗浄します。対流式オーブンでセルを乾燥させます。4ミリリットルのタンパク質溶液を細胞にロードし、キャップで閉じます。
ワックスフィルムまたは任意のシーラントを使用して、サンプルセルを密封します。4ミリリットルの透析バッファーをタンパク質サンプルと同じ容器にロードし、密封します。サンプルをビームラインに輸送します。
シャッターを閉め、分光器エンクロージャの洞窟エリアに入ります。ネジと保持プレートを締めて、サンプルセルをアルミニウムサンプルホルダーに取り付けます。グラファイト試料及び酸化アルミニウム粉末試料をタンパク質試料と同じ容器に装填してマウントする。
同じホルダーを温度強制システムの缶に静かにスライドさせて置きます。温度強制システムの蓋を閉じ、温度強制システムの対話型画面にアクセスして、温度を所望の値に設定します。中性子カメラを取り付けて、サンプルをビームにアライメントします。
中性子スピンエコー分光法データを収集するには、中性子カメラと4つの独立したサンプル開口部を使用して、中性子ビーム内のサンプルを整列させます。Spallation Neutron Source、Neutron Spin Echo Spectroscopyデータ収集ソフトウェアを開き、目的の散乱角度と波長の屈折スキャンを実行してサンプル統計を収集します。各サンプルについて収集された統計に基づいて測定パラメータを設定するには、補助機器科学者が提供する測定マクロを編集します。
コマンド プロンプターでプロトコル名を入力し、サンプルのエコーを取得してスキャンを開始します。ORNLユーザー資格情報で中性子科学リモート分析クラスターにログインし、セッション起動ボタンを押します。ユーザーディレクトリで、ターミナルウィンドウを開き、ソフトウェアセットアップコマンドを入力します。
次に、環境コマンドを入力します。ホームディレクトリにデータ削減用のフォルダを作成し、提供されたスクリプトとマクロを共有ディレクトリからコピーします。それに応じて提供された縮小マクロを編集、名前変更、保存します。
コマンドプロンプターでdrspine"と入力し、Enterキーを押してソフトウェア削減環境を開始します。ソフトウェア環境内のコマンド プロンプターに縮小マクロの名前を入力し、Enter キーを押します。支援機器サイエンティストが提供する Python スクリプトを、縮小されたファイル データの名前で編集します。
提供されたライブラリから収まるように関数を編集します。編集したスクリプトの名前をコマンド プロンプターに入力し、Enter キーを押して、縮小された NSE データの読み取り、適合、およびプロットを行います。NSEによって測定されたIgGおよびMBPタンパク質の中間散乱機能は、短い4年間の時間スケールでの単純な拡散様緩和プロセスからの明確な偏差を示し、NSEによるタンパク質内部ダイナミクスのアクセシビリティと、観察された動的プロセスを記述するためのより複雑なモデルの必要性を示している。
によって開発されたモデルを用いた両タンパク質の原子モデリングによる中間散乱関数計算の結果は、実験NSEデータと非常によく一致していた。その結果、より長い時間に観測される遅いダイナミクスは、全体的な並進および回転拡散プロセスに起因する可能性があり、短い時間スケールで観察されるダイナミクスはタンパク質ドメインのダイナミクスに起因する可能性があることが証明された。覚えておくべき重要なことの1つは、NSE測定のためによく準備されたクリーンなサンプルの必要性です。
スピンエコーに適したサンプルのフリップ比は3より高く、これはサンプルのコヒーレント散乱と非コヒーレント散乱の比です。また、サンプル調製およびNSE細胞へのサンプルローディング中、サンプル溶液は安全に保たれ、化学的または生物学的交差汚染がない状態に保たれる必要があります。安全上の理由から、分光計エンクロージャの入り口は、シャッターが閉じられ、エンクロージャの放射冷却のためにさらに30分の時間が許された後にのみ試行されるべきです。
小角中性子散乱は、濃縮溶液中のタンパク質の形状と構造を評価するために推奨されます。これは、NSE実験の前または並行して行うことができます。動的光散乱や粘度測定などの追加の方法は、濃縮タンパク質溶液内の並進拡散および流体力学相互作用に関する情報を提供し、また推奨されます。
