La dispersión biológica de rayos X de ángulo pequeño proporciona mediciones estructurales de complejos macromoléculas y macromoleculares. Idealmente, la muestra a medir debe ser monodispersa. Aunque en algunos casos, la cromatografía de exclusión de tamaño SAXS no es suficiente para producir monodispersidad, se puede realizar una desconvolución basada en software de los datos SAXS para producir una curva SAXS idealizada.
Siguiendo este protocolo, un programa de desconvolución y el programa de dispersión fácil de usar se pueden utilizar para analizar los mutantes de la exominus de ADN de virus de Vaccinia. Para realizar una resta de fondo de los datos de cromatografía de exclusión de tamaño, abra el programa Scatter 4 basado en Java y abra la pestaña SEC. Arrastre y suelte los archivos de datos reducidos en la ventana de colocar datos de abajo y haga clic en el botón del directorio de salida y ábralo para establecer el directorio de salida en el que se guardarán los datos.
Escriba el nombre del ejemplo en el cuadro Guardar como y haga clic en Seguimiento. Haga clic en el botón editar detalles para editar los detalles experimentales y rellenar los campos adecuados. Para seleccionar los marcos de búfer manualmente, haga clic en Establecer búferes.
Haga clic con el botón izquierdo del izquierdo y arrastre para volver a seleccionar el búfer como plano en la curva de seguimiento antes del volumen vacío de la columna de cromatografía de exclusión de tamaño de aproximadamente 100 fotogramas y haga clic en establecer búfer y actualizar para volver a calcular el archivo SEC. Haga clic con el botón izquierdo del izquierdo y arrastre para seleccionar una región de interés en el trazado de señal y haga clic con el botón izquierdo y arrastre las cruzs en el trazado del mapa de calor para seleccionar el zoom y el subconjunto de fotogramas que se utilizarán para la fusión. Con otro clic izquierdo, resalte los marcos en el mapa de calor correspondientes al área de la parte inferior derecha de las cruzs.
Idealmente, el marco debe resaltar una región con un color predominantemente cian y un radio estable de giro. Cuando esté satisfecho con los marcos seleccionados, haga clic en Combinar para combinar los marcos restados y haga clic en la pestaña de análisis para ver los datos. Para la desconvolución de los datos, cargue el conjunto de datos en el programa de desconvolución.
En el panel de control de los archivos, utilice el símbolo de carpeta para localizar los datos y resaltar todos los archivos DAT. En la gráfica de serie se dibujará una gráfica de intensidad integrada frente al número de fotograma. En la pestaña serie, haga clic para resaltar la curva y abrir la ventana emergente de análisis LC.
Para seleccionar una región de búfer adecuada, haga clic en Agregar región para seleccionar un área antes del pico del cromatograma y una después del frente del disolvente y haga clic en establecer búfer. Las ventanas emergentes indicarán que los marcos no se han seleccionado para el fondo. Para iniciar el EFA, haga clic con el botón derecho en el archivo resaltado y seleccione EFA en el menú.
En la ventana emergente, se debe observar la descomposición del valor único del conjunto de datos. En el cuadro de controles, active los valores del cuadro Usar fotogramas para confirmar que toda el área de pico a desconvolucionada está cubierta en la gráfica de intensidad. La gráfica de valores singulares mostrará la intensidad de los valores singulares por encima de la línea base.
Si los vectores individuales izquierdo y derecho no coinciden, cambie el número vectorial singular significativo a dos y mueva los fotogramas hasta que los vectores singulares izquierdo y derecho sean similares. Se calculará la EFA, generando trazados en las direcciones hacia adelante y hacia atrás para cada vector e indicando cuándo los componentes inician y salen del perfil de solución para los datos SAXS de cromatografía de exclusión de tamaño seleccionados. RAW intentará identificar los rangos.
Si es necesario, utilice las flechas para cambiar los rangos de modo que cada círculo sea el inicio de un punto de inflexión, subiendo o cayendo a la línea base y haga clic en siguiente. Para reducir o eliminar picos, identifique aproximadamente qué fotograma corresponde al pico utilizando las flechas de control de rango para ajustar los controles de rango de componentes. Cuando se haya logrado un cuadrado de Chi mínimo, haga clic de nuevo para realizar una comprobación de validación.
Si los trazados EFA originales siguen siendo válidos, haga clic en Siguiente y guarde los datos de EFA para guardar los trazados. A continuación, haga clic en hecho para cerrar la ventana EFA. A continuación, en la ventana RAW, abra perfiles en el panel de trazado para ver las curvas.
En la pestaña Perfiles del panel de control, haga clic con el botón derecho del 200a derecha para guardar las curvas como archivos DAT. Para la determinación SAXS, abra la pestaña Análisis de dispersión y seleccione G para seleccionar la herramienta de análisis manual de Guinier. En la gráfica, añada o elimine puntos de forma que los residuos no tengan una función de sonrisa o ceño fruncido.
Los datos seleccionados en el ajuste Guinier no deben exceder la cola máxima multiplicada por el radio del límite de giro de 1,3. Haga clic en Kratky normalizado. La gráfica resultante proporciona una evaluación del estado estructural de la macromolécula, globular, cilíndrica, desordenada, normalizada para la masa y la concentración.
Haga clic en el volumen de correlación. La intensidad total dispersa y un área integrada de la intensidad dispersa total en función de las gráficas Q aparecerán como una referencia rápida para validar la calidad de la curva de dispersión. Para iniciar el análisis de flexibilidad, haga clic en flexibilidad.
Cada panel en la ventana emergente mostrará una trama explotando una relación de ley de poder que existe entre los biopolímeros flexibles compactos y alargados. Utilice el control deslizante situado en la parte inferior del cuadro para cambiar la vista de los datos hasta que se alcance una meseta en uno de los trazados. Inmediatamente después de realizar un análisis de flexibilidad, haga clic en el volumen.
Se generará una ventana emergente de tres gráficos. El trazado Porod-Debye realiza un seguimiento de los lugares en los que se dejó el control deslizante de la gráfica de flexibilidad y muestra los datos de área de meseta. Para calcular el volumen de la partícula, mueva los puntos inicial y final hasta que la línea azul del trazado se ajuste a la región estanda.
Para un resultado imparcial, los residuos en el ajuste de la ley de poder del exponente Porod-Debye no deben mostrar ningún patrón. En la ficha P de R, se puede observar la distribución del espacio real y la curva de dispersión de la muestra. Idealmente, la curva de distribución debe ser suave sin ondas y debe tocar suavemente el eje X.
Haga clic con el botón derecho en el nombre del ejemplo y haga clic en Buscar DMAX para abrir una nueva ventana. Los límites de la cota máxima se preestablecen con el rango Q máximo sugerido, los puntos de datos máximos que se utilizarán para el cálculo, los límites de dimensión máxima inferior y superior y una puntuación alfa inferior y superior. Haga clic en Inicio.
Se creará una distribución compuesta junto con una dimensión máxima sugerida y un nivel alfa. Si estos datos son aceptables, cierre la ventana para volver a la ficha P de R donde ahora se recortará la gráfica de espacio recíproco para que coincida con el rango Q máximo sugerido. Seleccione el modelo más y haga clic en fondo para establecer el nivel alfa y la dimensión máxima en los valores sugeridos en el cuadro emergente.
Haga clic en refinar. Se abrirá una gráfica de validación cruzada, que muestra si los puntos tenían que ser rechazados como se indica en rojo. Si sólo hay unos pocos puntos rechazados y la distribución se ve bien, entonces el modelo es bueno.
Imprimirá un informe en la pestaña de análisis. Haga clic con el botón izquierdo del 200 de la muestra para resaltar el ejemplo y haga clic con el botón derecho en el nombre del ejemplo. Seleccione crear informe desde el único conjunto de datos.
Se abrirá un cuadro de texto para permitir comentarios y se generará un documento PDF que muestra todas las cifras y valores generados. En este análisis representativo, E9 DNA polimerasa exonucleasa minus mutante se unió al ADN y se ejecutó utilizando cromatografía de exclusión de tamaño dispersión de rayos X de ángulo pequeño. Se observaron dos picos.
El primer pico grande representa la exonucleasa de ADN polimerasa E9 menos el complejo de ADN mutante. Y el segundo indica el estado sin enlazar. Mientras que el enfoque clásico de la selección de marcos proporciona un radio estable de giro del complejo en el primer pico, el segundo pico se fusiona claramente y el radio de giro a través de la gráfica muestra que el segundo pico de interés no tiene un radio estable de giro debido a la contaminación de pico cruzado.
En este análisis, sólo se podían utilizar cinco fotogramas que mostraban un radio semiestable de giro. Cuando se restaron, dieron un radio de giro de 36,3 angstroms. Cuando los picos fueron desconvolucionados usando EFA, la curva correspondiente para el segundo pico se superó con el original, mostrando una clara disminución en la señal al ruido y un radio más bajo de giro de 34.1 angstroms.
Una gráfica Kratky de los datos revela que el complejo con el pico enrevesado es más gloular como lo confirma la curva PR que da una dimensión máxima de 108,5 angstroms para la curva desconvolución. Los datos no desconvolucionados para este análisis son más alargados con una dimensión máxima de 120 angstroms, probablemente debido a la heterogeneidad derivada de la polimerasa E9 sin ataduras menos la exonucleasa mutante. Los pasos más críticos son en la selección de los valores singulares y el rango de datos utilizados, ya que estos afectan en gran medida a la precisión de la desconvolución.
Los resultados no deben tomarse por sí solos, sino que deben evaluarse más adelante utilizando técnicas adicionales como la centrifugación analítica o la dispersión de luz láser multiángulo para permitir su interpretación biológica. SAXS acoplado a columnas en línea en combinación con la desconvolución y una interfaz fácil de usar como el programa Scatter proporciona es un paquete potente para proporcionar datos estructurales significativos incluso de sistemas intrínsecamente difíciles.
