FAPsは筋肉再生および病理学的線維症のメディエーターであるため、我々のプロトコルは、FAPダイナミクスポスト筋肉損傷およびin vitroまたはex vivo研究のためのFAPsの単離の特徴付けを可能にする。現在までに、マウスから分離されたFAPsに関する研究が行われてきました。当社のプロトコルは、より大きなラットからのFAPsの効果的な分離を可能にし、下流アッセイにはるかに大きな組織可用性を提供します。
長期の組織処理時間は、FAPsの生存率に悪影響を及ぼす可能性があります。複数のサンプルを同時に処理する場合、2 つのオペレーターがプロトコルを並行して実行して、分離された細胞の生存率を最大化することをお勧めします。採取した筋肉組織を無菌10センチメートル細胞培養皿に入れることから始めます。
組織を鉗子で軽く引き裂いてミンチし、結合組織を取り除き、約3〜4ミリメートルの立方体片を得る。6ミリリットルのDMEMと1%ペニシリンストレプトマイシンを含む無菌50ミリリットルの円錐管にミンスター組織を移す。次に、300ミリモルの塩化カルシウム溶液を10マイクロリットル加えてコラゲラーゼII溶液を365マイクロリットル活性化します。
活性化コラゲラーゼII溶液を組織スラリーに加えるため、1ミリリットル当たり250単位の最終濃度を得ます。チューブの側面に付着した組織を取り除くために、1時間、240 x gで37度の摂氏37度でチューブをインキュベートします。1時間のインキュベーションの後、100マイクロリットルのコラゲザーゼIIと50マイクロリットルのディスパーゼをサンプルに加えます。
次いで、溶液が均質になるまで、血清ピペットを使用してピペットサンプルを15〜20回使用する。サンプルを摂氏37度で30分間、15分ごとに手動で240 x gずつインキュベートします。20ミリリットルの注射器を通して筋肉溶液サンプルをゆっくりと剪断し、20ゲージの針を10サイクルで切り取ります。
その後、40ミクロンの細胞ストレーナーを無菌50ミリリットルの円錐管に置き、10%FBSと1%ペニシリンストレプトマイシンを補充したDMEMの5ミリリットルをピペットで湿らせる。サンプルをストレーナーを通して一度に1ミリリットルをピペットします。サンプル全体を濾過したら、10%FBSと1%ペニシリンストレプトマイシンを補ったDMEMでセルストレーナーを洗い、サンプルの総体積を25ミリリットルにします。
サンプル体積を15ミリリットルの円錐形チューブ2つに均等に分割し、遠心分離機を摂氏15度、400 x gで15分間分割します。遠心分離後、上清を吸引し、ペレットを室温で1ミリリットルのRBCライシスバッファーに7分間再懸濁する。その後、9ミリリットルの洗浄バッファーを加え、体積を摂氏15度、400 x gで15分間10ミリリットル、遠心分離機に持ち込みます。
遠心分離後、上清を吸引し、ペレットを1ミリリットルの洗浄バッファーに再懸濁させる。適切な量の細胞を別の1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移し、トリパンブルー染料と混ぜます。ヘモサイトメーターを用いて、光顕微鏡で生細胞を数える。
フローサイトメトリーの場合、実験サンプルあたり1〜200万個の細胞を無菌1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに移します。サンプルの体積を洗浄バッファーで 1 ミリリットルにし、チューブを氷の上に置きます。実験のすべてのコントロールを設定します。
細胞コントロールの場合、アリコート500、000〜100万細胞を1ミリリットルの洗浄バッファー内の1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに入れ、氷の上に置く。実験が初めて行われる場合は、単染色細胞懸濁液も含める必要があります。ビーズコントロールを設定するには、ラベル付けされた1.5ミリリットルの遠心分離管それぞれに約150,000個の正補正ビーズを追加します。
生存率チューブから細胞体積の半分を移し、死んだラベルの1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブをリフレッシュして生存率制御を準備します。死んだチューブを摂氏65度で2~3分間インキュベートし、氷の上に置きます。インキュベーション後、死んだ細胞を生存チューブに戻します。
500 x gおよび摂氏4度の実験および対照サンプルを含む単細胞懸濁液を遠心分離し、上清を吸引した後、100マイクロリットルの洗浄バッファーで細胞ペレットを再懸濁する。制御条件または実験条件に従って抗体を追加し、サンプルを軽くフリックして完全な混合を確実にします。その後、暗闇の中で氷の上で15分間インキュベートします。
補償ビーズの場合は、暗い温度で15分間チューブをインキュベートします。1細胞の懸濁液に900マイクロリットルの洗浄バッファーを加え、補償ビードコントロールのために900マイクロリットルのPBSを加えることによって、各サンプルの体積を1ミリリットルに持って来なさい。遠心分離機単一電池懸濁液は500 x g、摂氏4度で5分間、補償ビーズは300 x g、摂氏4度で5分間コントロールします。
サンプルの遠心分離後、上清を吸引し、細胞ペレットを300マイクロリットルの洗浄バッファーに再懸濁し、ビーズは300マイクロリットルのPBSおよび150,000の負の補償ビーズで制御する。氷上の細胞サンプルとビーズサンプルをアルミニウム箔の下で室温に保ちます。フローサイトメトリーの取得を進めるため、線維-刺激性前駆物質および筋原性前駆物質を同定する格子戦略を設定します。
代表的な分析では、健康ラット胃腸筋から発生した報酬ビーズおよび細胞懸濁液の単一染色を伴うSca-1 APC抗体の結合に成功することが確認された。Sca-1 APCの5つの異なる濃度を単細胞懸濁液に滴定し、最小限のバックグラウンド染色で最大の蛍光強度に基づいて抗体の最適濃度を同定した。ラット胃腸管内のFAPsおよびMPのフローサイトメトリック同定は、ここに示す格子戦略を用いて行った。
サンプルは、ビーズを数える破片を除外するために最初にゲートされました。次に、細胞をゲートして、前部散乱および側面散乱特性の両方によって二重を除外した。得られた細胞の生存率をSYTOXブルーで染色することにより評価した。
SYTOXブルーネガティブシングルは、リン+フラクションを除外するためにCD31とCD45について評価された。リン集団が評価された。Sca-1に対して単一陽性であった細胞は、FAPを指定し、VCAM-1に対して単一陽性であった細胞を、MPに指定した。
並べ分け後すぐに共同免疫染色を行い、新たに単離されたFAPsの集団は、Pax7陽性細胞による汚染のないPDGFRalphaに対して陽性染色を示した。逆に、MPの分類された集団は、PDGFRalpha陽性細胞の不在でPax7に陽性に染色された。FAPsは、線維芽細胞特異的タンパク質1およびペリリピン1の発現を有する脂肪発生分化培地において、12日目に分化線維芽細胞および脂肪細胞をそれぞれ実証した。
成熟した脂肪細胞からの中性トリグリセリドおよび脂質の存在は、オイルレッドO染色で明らかであった。さらに、FAPsはコラーゲン型Iの存在とミオサイトの汚染の欠如を実証した。12日目に筋形成分化培地で増殖したMPは、成熟した筋細胞と融合した多核筋管の存在を示し、線維芽細胞および椎細胞汚染を明らかにした。
この技術を使用して、長期間培養するために生きた細胞を単離する場合、研究者は無菌技術を使用し、同時に良好な細胞生存率を確保するために効率的に作業する必要があります。
