このプロトコルは、静止と傷害誘発性活性化線維芽細胞集団の両方を有意な純度で分離することを可能にする。この技術の主な利点は、即興のための柔軟性です。フローは、ビーズベースの単離と同様に、汚染細胞に対する抗体を組み込んで、単離された標的細胞からそれらを除外することができる。
この技術は、主に心臓線維芽細胞の分離に使用されます。しかし、他の組織から線維芽細胞を単離するために利用することができる。この手順を実証するには、学部のインターンであるメイリング・メルツァーと、私の研究室の研究アシスタントであるデビッド・ベアーです。
解剖中に6つの心臓を貯蔵するための6ウェルプレートを準備するには、各井戸に冷たいKHBの2ミリリットルを分配し、氷の上にプレートを置きます。70%エタノールでボディをスプレーします。腹側が実験者に向かるように向きます。
干渉を防ぐために付属物を固定します。肝臓を突き刺さずに、腹の皮膚と筋肉を切り開きます。胸骨に向かって垂直に切り、心臓を突き刺さずに胸郭を慎重に開けます。
次に、胸部を切り抜いて心臓を露出します。鉗子を使用して、心臓を胸からそっと持ち上げ、心臓の外側に付着した肺または余分な組織を切り取ります。左心室を分離します。
解剖ごとに、6ウェルプレートの別々のウェルに心室を置きます。まず、過剰な血液を除去するためにKHBの心室を繰り返し圧迫し、攪拌するために鉗子を使用する。心室を清潔で無菌の10センチメートル平方プレートに移します。
次に、片刃の刃を使用して、すぐに小片に心室をミンチ。コラゲターゼ消化カクテルを1ミリリットル加え、ミンチを続けます。1ミリリットルのマイクロピペットで転写するのに十分な小さい場合は、50ミリリットルの円錐管に移します。
2ミリリットルのカクテルでプレートを2回洗い、チューブに移します。チューブを30分間インキュベートし、5ミリリットルのピペットを用いて原稿に記載されているように細胞を再懸濁する。最初の再懸濁液の後、細胞を15分間インキュベートし、10ミリリットルのピペットを使用して再び再懸濁する。
次に、新しい50ミリリットルの円錐チューブの上に40マイクロメートルの細胞ストレーナーを置き、1〜2ミリリットルのKHBで湿らせ、ストレーナーをプライミングします。消化懸濁液に25ミリリットルのKHBを加え、再中断する。ストレーナーを通して懸濁液をフィルターし、必要に応じてストレーナーを交換します。
濾液を400g、摂氏4度で10分間遠心分離する。上清を取り除き、1心臓当たり5ミリリットルのバッファーを使用して1x RBCライシス緩衝液中のペレットを再懸濁させた。懸濁液を室温で2分間インキュベートした後、室温で10分間400回gで懸濁液を遠心分離する。
上清を取り出し、KHBの1ミリリットルでペレットを再懸濁します。その後、9ミリリットルのKHBを懸濁液に加える。プライミングされた40マイクロメートルのセルストレーナーを通して、新しい50ミリリットルの円錐管に懸濁液をフィルターします。
円錐管を室温で10分間400回gで遠心する。最後に、上清を取り除き、1ミリリットルの線維芽細胞培地またはPBS中のペレットを再懸濁させた。細胞数が決定された後、線維芽細胞は、原稿に記載された3つの異なる方法によって懸濁液から単離することができる。
差動めっきによる分離を開始するには、各ウェルに2ミリリットルの線維芽細胞培地を加えて6ウェルプレートを調製します。プレートを旋回して井戸底を覆います。マウス心臓細胞がPBSで懸濁される場合、遠心分離機および心臓あたり1ミリリットルの線維芽細胞培地中で再懸濁する。
各ウェルに1つの心臓に相当する細胞懸濁液を1ミリリットル加えます。均一に細胞を分配するためにプレートを旋回します。井戸あたり最大4ミリリットルの総体積のために井戸あたり線維芽細胞培地の追加1〜2ミリリットルを追加します。
摂氏37度で4時間インキュベートします。線維芽細胞は選択的にウェルに付着するので、それらは培地を取り除いて捨てて単離することができる。残りの取り付けた細胞を2ミリリットルのPBSで洗い、それからウェルあたり2〜4ミリリットルの無菌線維芽細胞培地を加える。
コンフルエントまで37度でインキュベートし、2~4日ごとにメディアを交換します。CD45陽性造血細胞の磁気標識と分離を開始するために、500倍gのマウス心臓細胞の懸濁液を5分間遠心分離する。上清を取り除き、細胞ペレットを平衡バッファーの1ミリリットルで再懸濁させた。
ヘモサイトメーターを使用して細胞を数えます。再び細胞を遠心した後、細胞ペレットを平衡バッファーに再懸濁させる。CD45正の磁気ビーズを加え、よく混ぜます。
摂氏4度で少なくとも15分間インキュベートする。平衡バッファーを加えて、摂氏4度で10分間500倍の遠心分離機を加えて細胞を洗います。上清を取り除き、ヘモサイトメーターを用いて細胞を数える。
平衡バッファー内のペレットを再懸濁します。細胞凝集が分離カラムを詰まらせるのを防ぐために、40マイクロメートルのフィルターを通して懸濁液を通過させる。次に、適切なセパレータの磁場に分離カラムを配置し、少なくとも3ミリリットルのPBSでカラムを平衡化する。
カラムを通して細胞懸濁液を注ぎ、ラベルのない細胞を含むフロースルーを15ミリリットルの円錐チューブに集めます。3ミリリットルの平衡バッファーでカラムを3回洗浄し、洗浄液とフロースルーを組み合わせます。区切り記号から列を取り外し、15 ミリリットルの円錐管にカラムを置きます。
標識したCD45陽性細胞を、5ミリリットルの平衡バッファーをカラムにピペットし、カラムをしっかりと突き出す。500倍gで流れ管のチューブとのチューブを遠心分離する。ヘモサイトメーターを使用して細胞を数えます。
分離を完了するには、CD31陽性内皮細胞およびMEFSK4陽性線維芽細胞の原稿のプロトコルに従ってください。蛍光活性化細胞選別は、心筋梗塞後のα-SMA-GFPマウス心臓から単離された単一細胞に対して行った。代表的な格言方式は、CD31、CD45、またはAN2を共同発現するGFP陽性細胞を示す。
負傷したマウスの心臓では、内皮細胞および造血細胞のごく一部がGFPを発現した。しかし、GFP陽性/CD31陰性/CD45陰性細胞は、AN2、ペリサイトマーカーを発現しなかった。gFP陽性細胞はα-SMA、コラーゲン1α1、ペリオスチン、ビメンチンを発現した。
選択的接着によって単離された傷ついていない線維芽細胞は、ビメンチンを発現したが、α-SMA、ペリオスチン、またはコラーゲン1α1の発現を示さなかった。けがのない線維芽細胞と活性化線維芽細胞の両方がMEFSK4抗原を発現した。両方の負傷していない線維芽細胞は、選択的接着によって単離され、筋線維芽細胞は、α-SMA-GFPマウスから単離および選別され、コラーゲンを収縮させる能力を示した。
インキュベーションの前に組織を十分にミンチすることが重要です。ビーズベースの分離の前に、細胞凝集を防ぐために40マイクロメートルのフィルターを通して懸濁液を通過することが重要です。この方法で精製された細胞は、高いレベルの純度を確保するために、ペリサイト特異的抗体に関連する磁気ビーズを使用してさらに精製することができる。
新しいビーズ共役抗体とレポータートランスジェニックマウスの利用により、これらの技術を利用して、線維芽細胞だけでなく、異なる細胞集団を単離して研究することができます。
