マウス初代肝細胞は肝臓研究において重要である。特に糖代謝、および肝薬物検査のために。時間的には、分離プロセスには時間がかかり、エネルギーにはコストがかかる可能性があります。
このプロトコルは、マウス初代肝細胞を単離するための効率的な方法を提供することができる。時間と労力にやさしいです。市販されているすべての地域で非常に少数のステップを必要とします。
まず、ペリスタルティックポンプを使用して、ウォームアップした二重蒸留水を毎分4mLの速度で5分間ポンプで汲み上げ始めます。その後、ポンピングチューブを水からウォームアップ灌流培地に変更します。水と灌流培地との間の気泡を監視する。
システムを通る灌流媒体の流れを追跡するのに役立ちます。次に麻酔をかけ8週齢のC57黒色6Jメスマウスの腹部を70%エタノールで消毒する。そしてはさみを使って腹部を切り開き、肝臓、門脈、下大静脈を露出させます。
その後、ペリスタルティックポンプを停止します。ポンピングチューブに水ではなく灌流媒体が含まれていることを確認した後。下大静脈に24ゲージのカテーテルを挿入します。
ポンプの電源を入れ直し、門脈を切断します。灌流培地がポンプで送られている間、液体が肝臓の隅々まで届くように、門脈を毎分押します。約3〜5分間、または洗い流された液体が透明になるまでポンプで汲み上げ続けます。
次にポンピングチューブを灌流培地からコラゲナーゼディスパーゼ培地に変更する。そして、液体が肝臓の隅々まで届くように、毎分門脈を押します。25mLのコラゲナーゼディスパーゼ培地がすべて枯渇するまでポンピングを続けます。
次に、胆嚢なしで肝臓全体を単離する。これを氷上のシャーレに入れた30mLの洗浄培地に入れた。鉗子を使用して肝臓を細かく引き裂き、初代肝細胞を溶液中に放出する。
この段階で、洗浄培地は、放出された初代肝細胞および小さな肝臓片を含む白濁した溶液に変わる。この白濁した溶液を 70 ミクロンのセル ストレーナーでろ過し、氷上の 50 mL チューブ内のコールあたり 1 倍の 1 倍の HBSS 20 mL に入れます。チューブを20回反転させて溶液を混合する。
次に溶液を遠心分離する。次いで、組織培養フード内で、上清を吸引する。ペレットを30mLの冷洗浄媒体で洗浄した。
遠心分離で細胞をもう一度ペレット化する。上清を除去し、ペレットを25mLの培養液に再懸濁した。細胞を数え、所望の培養プレートにそれらをプレート化する。
実験計画による。プレーティング後、単離された初代肝細胞は1時間で強固に付着し、12時間後に完全に増殖した。単離された肝細胞において、トランスサイレチン、CD95、ASGR1、およびASGR2などの肝細胞マーカーのmRNAレベルは、肝臓全体と比較して有意に増加した。
対照的に、免疫細胞、星状細胞、および内皮細胞の存在は低かった。CD45の急激な減少によって証明されるように、コラーゲン1型α1、および内皮細胞2キナーゼ2mRNAレベル。このプロトコルが他の肝細胞からの干渉を大幅に低減できることを示唆する。
めっき後、ASGR1およびASGR2レベルは時間とともに減少したが、12時間の時点まで肝臓全体に匹敵するままである。特にASGR1の場合。膜結合CD81の発現レベルは、最大48時間一貫していた。
対照的に、toll様受容体4発現は一般に増加し、48時間後にインビボレベルよりも高くなった。インスリン感受性アッセイは、インスリンがセリン473における両方のAKTのリン酸化を有意に促進することを実証した。フォークヘッドボックス01をセリン256にて、肝細胞とする。
インスリンに対する初代肝細胞の感受性を示す。ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼタンパク質レベルは、グルカゴン処理後に有意に増加した。グルコース産生経路が活性化されたことを示唆する。
この活性化は、グルコース産生の増加によってさらに確認された。そして、フォルスコリン+ IBMXのような他のグルコース産生刺激剤と.このプロトコルは、マウス初代肝細胞を用いた研究のための時間とエネルギーの両方を節約することができる。
このプロトコールに従って、仮説的なグルコース代謝および医薬バイオマーカーアッセイなどの関連実験を行うことができる。
