このプロトコルは、初代マウス肝細胞における総ミトコンドリアおよびペルオキシソーム脂肪酸β酸化の測定のための堅牢な方法を提供するために開発された。無傷の細胞を使用することで、オルガネラの完全性と調節機構が維持されます。さらに、新たに単離された肝細胞をアッセイすることにより、起源の肝臓に対する遺伝子発現の変化が最小限に抑えられます。
手術は困難な場合があります。自信を持ち,勤勉で,集中しなければなりません。カニューレが成功したら、リラックスしてみますが、注意を払って灌流の質を監視してください。
手順を開始するには、麻酔をかけられたマウスの腹部および胸部に70%エタノールを自由に噴霧する。次に、鉗子を使用して腹部の基部近くの皮膚および腹壁を引き上げ、正中線の両側および横隔膜まで横方向に切断して器官を露出させる。腸を右側に動かし、肝臓の葉を静かに上にひっくり返すことによって、下大静脈、またはIVCを露出させる。
ニードルキャップなどの小さな円筒形の物体をマウスの背面の下に挿入して、IVCをわずかに傾けてカニューレを容易にします。バッファー1でポンプを最低速度で始動した後、IVCに針を挿入します。その後、門脈を切断して圧力を和らげ、血液および灌流緩衝液の排液を可能にする。
流量を毎分7mLに増加させる前に。温かいバッファー 1 で肝臓を灌流し、バッファー 1 を含むチューブに挿入されたラインが気泡の導入を避けるために連続的に沈んだままであることを確認します。灌流が起こる間、130マイクロリットルのコラゲナーゼ溶液を緩衝液2個に加え、血清学的ピペットでピペッティングして混合する。
緩衝液1を含むチューブ内の体積が約5mLに減少するように、チューブの側面にピペッティングにより緩衝液1に緩衝液2を5mLずつ加える。残りの緩衝液を2本チューブに加える前に、添加を2回繰り返した。約5〜10mLの緩衝液2本がチューブ内に残されたら灌流を停止する。
次いで肝臓を切除し、20mLの氷冷緩衝液2つを含む100mL培養皿に移す。層流フードの下で、外科用はさみとピンセットを使用して肝臓組織を静かに分解します。次に、約20mLの氷冷M199緩衝液を肝細胞懸濁液に加え、シリンジのプランジャーを使用して100ミクロンの細胞ストレーナーを通して濾過し、より大きな肝臓片からの追加の肝細胞の放出を穏やかに促進する。
100mL培養皿とセルストレーナーをM199バッファーで洗浄し、回収チューブがいっぱいになるまで細胞懸濁液を回収した。次いで、懸濁液を50 x gで摂氏4度で2分間遠心分離する。肝細胞ペレットを旋回させて30mLの冷たいM199に再懸濁させる前に上清を吸引する。
洗濯を1回繰り返します。パルミチン酸とウシ血清アルブミン、またはBSA溶液を解凍してから、複数の反応のための基質混合物を調製する。微量遠心管内の反応あたり13.5マイクロリットルのBSA溶液をアリコートする。
チューブを摂氏41度に加温した後、反応ごとに1マイクロリットルの200mMパルミチン酸溶液を加える。可溶性パルミチン酸 - BSA複合体の形成を促進するために、摂氏41度で20〜30分間インキュベートの前後にチューブを激しく渦巻きます。この間、133マイクロリットルの1Mの過塩素酸をアリコートし、これを別々の1.5mLマイクロ遠心管で反応を停止するために使用する。
反応を開始する前に、反応ごとに485.5マイクロリットルのM199バッファーを摂氏37度のチューブにアリコートしてインキュベートし、調製した放射性BSA−パルミチン酸複合体を希釈する。次に、インヒビターの有無にかかわらず750マイクロリットルのM199を別々の14mL丸底チューブにサンプルとして分注する。肝細胞洗浄ステップの間、反応を開始する10〜15分前に、毎分180〜200回転で摂氏37度に設定した振とう水浴にチューブを移す。
肝細胞の生存率が少なくとも75%である場合、澄化されたBSA−パルミチン酸溶液を含む微量遠心管に反応当たり0.8マイクロリットルの炭素−14パルミチン酸を移すことによって基質混合物の調製を完了する。チューブを摂氏41度の水浴に戻す前の渦。最終的な肝細胞再懸濁の直後に、750マイクロリットルの肝細胞懸濁液を1mLピペットを用いて振とう水浴中の14mL丸底チューブの各々に移し、チューブを低速で短時間渦巻き、インキュベーターに移す前に、各添加を30秒ずつずらした。
肝細胞の別のアリコートを1.5mL微量遠心チューブに移し、3000 x gで5分間スピンする。ペレットをマイナス80°Cで保存する前に上清を除去し、サンプル中のタンパク質の総量を測定し、結果を正規化した。肝細胞が摂氏37度でプレイインキュベーションされている間、放射性BSA-パルミチン酸複合体を温かい培地に加え、反応を開始する準備ができるまで摂氏37度に保ちます。
反応を開始するには、肝細胞をウォーターバスから取り出し、500マイクロリットルの基質混合物を肝細胞に加える。細胞を低速で5秒間渦巻き、その後水浴に戻り、15分間インキュベートする。一連の反応を開始し、バックグラウンド放射能を決定するために直ちに停止する。
残りの基質混合物の200〜250マイクロリットルの重複アリコートを6mLシンチレーションバイアルに移して脇に置いて、計数を行う。反応を止めるには、肝細胞をウォーターバスから取り出し、適度な速度でボルテックスすることによって再懸濁し、次いで400マイクロリットルの肝細胞懸濁液を過塩素酸を含む微量遠心チューブに移す。すべてのサンプルについてシーケンスを繰り返す前に、直ちにチューブをキャップして渦巻き、30秒ずらす。
1.5 mL マイクロ遠心チューブを 13, 000 x g で 10 分間スピンダウンした後、上清 300 マイクロリットルを 6 mL シンチレーションバイアルに移し、4 mL のシンチレーション液を加えて、サンプル中の放射能をカウントし、シンチレーションカウンターで基質混合アリコートをカウントします。研究では、肝臓灌流は、肝臓あたり30〜4000万個の細胞を産生し、平均生存率は80%であり、空腹時群のグルコース濃度を低下させることは肝細胞の収量または生存率に悪影響を及ぼさなかったことも観察された。給餌および絶食雄マウスから単離された肝細胞懸濁液を、CPT1およびミトコンドリア脂肪酸酸化の強力な阻害剤であるエトモキシルの存在下および非存在下での脂肪酸β酸化能についてアッセイした。
バックグラウンド放射能に関連する1分あたりのカウント(CPM)は、パルミチン酸のバッチによって異なります。しかしながら、CPMは依然として基質混合物と共にインキュベートされたサンプルよりも有意に低かった。絶食マウスから単離された肝細胞は、ミトコンドリアおよびペルオキシソーム脂肪酸β酸化の両方の速度の堅調な増加を示す。
データはさらに研究され、給餌および絶食マウスから単離された肝細胞においてパルミチン酸が酸化される速度を決定した。気泡が線に入らないようにします。灌流中は針を安定させてください。
肝細胞を取り扱うときは優しくしてください。それらを分配するときは、それらを懸濁させてください。この手順から単離された肝細胞は、脂肪酸合成などの他の代謝経路をアッセイするための懸濁液として使用することができ、またはそれらは細胞培養実験のために播種され得る。
