このプロトコルは、3Dコラーゲンサンドイッチ環境におけるマウス肝細胞の分離および再現可能な長期培養を促進し、標準構造形成およびインビトロでの治療への応答を研究する。技術が習得されると、それはインビトロ研究のための非常に実行可能で純粋なマウス肝細胞集団の大量を得るための迅速な方法です。この手順のデモンストレーションは、研究室の技術者レンカ・サルノバです。
原発性肝細胞単離の前日に、10X DMEMの100マイクロリットル、蒸留水485マイクロリットル、および15マイクロリットルの水酸化モル15リットルをラットテールコラーゲン1に加える。中和したコラーゲンのpHを確認してください。それは約7.5でなければなりません。
冷蔵200マイクロリットルピペットチップを使用して、中和したコラーゲン溶液の100マイクロリットルを氷の上のプラスチック3.5センチメートル直径の培養皿のそれぞれに広げ、一晩標準的な培養条件下で皿を置きます。翌朝、1皿あたり37度PBSの1ミリリットルのコラーゲン層を摂氏37度で少なくとも3時間水分補給します。肝臓を単離するには、つま先ピンチに対する応答の欠如を確認した後、麻酔マウスを斜位の解剖マットの上に置き、下肢と上肢をマットにテープで貼る。
70%エタノールで腹部をスワブし、陰部から各前肢にV字型の切開を行います。胸の上に皮膚を折り畳んで腹腔を明らかにし、マットを解剖顕微鏡の下に置きます。小腸と結腸を尾大方向に動かしてIVCを露出させ、2.5ミリリットルの37°Cの溶液を使用してシリンジをカンヌラに接続し、PBS浸した綿棒を使用して肝臓を横隔膜まで押し上げます。
IVCの周りに浸した縫合糸を肝臓のすぐ下に置きます。次に、45度の角度に曲げた30ゲージ針を装備したインスリン注射器を使用して、1ミリリットルのヘパリンあたり10マイクロリットルをポータル静脈に注入する。肝臓をカンニューするには、マイクロサージカルハサミを使用して、肝臓のすぐ隣のIVCで小さな切開を行い、カニューレを切開に挿入します。
縫合糸と2つの外科的結び目でカニューレを所定の位置に固定し、灌流バッファーが肝臓から流出できるように門脈を切断します。その後、注射器プランジャーをゆっくりと落ち込ませ、約15秒間にわたって肝臓に2ミリリットルの溶液を浸透させる。すべての溶液が送達されたら、蠕動ポンプを新鮮な37°Cの溶液Cで予め充填し、灌流装置をチェックして、システムに気泡がないことを確認します。
慎重に注射器からカニューレを取り外し、迅速に、しかし慎重にカニューレに実行中の蠕動ポンプのチューブを接続します。すぐに毎分流量2.5ミリリットルで灌流を開始します。2分後、溶液Dに切り替え、さらに10分間灌流を続けます。
灌流の終わりに、慎重に第一次肝細胞を分離し、カニューレによって肝臓を保持 E.Toし、肝細胞をバッファーにノックするチューブの壁の周りに組織をこする摂氏37度溶液の20ミリリットルを含む50ミリリットルの円錐管に肝臓を収穫する。すべての組織がマッシュアップされたら、組織スラリーを70マイクロメートルの細孔ナイロンストレーナーに移して、単離された細胞を新しい50ミリリットルチューブにろ過します。遠心分離によって肝細胞を沈め、DMEMで40%パーコールの20ミリリットルでペレットを再懸濁する。
生細胞と死細胞を遠心分離によって分離し、ペレットを20ミリリットルの溶液で再懸濁させる。カウント後、肝細胞培地の1ミリリットル当たり5個の生存細胞に10倍の10倍の10倍の一次肝細胞数を調整する。3Dコラーゲンサンドイッチで単離された原発肝細胞を培養するには、1ミリリットルのピペットを使用して、直径3.5センチメートルの各コラーゲンコーティング皿に2ミリリットルの細胞を均等に分配します。
細胞培養インキュベーターに細胞を3時間置きます。インキュベーション中に、デモンストレーションのように1皿あたり1溶液中和ラットテールコラーゲン100マイクロリットルを調製する。インキュベーションの終了時に、培地と未接続の細胞を1皿あたり100マイクロリットルの中和コラーゲンに慎重に交換し、プレートを細胞培養インキュベーターに1時間戻します。
コラーゲンが固まったら、各皿に2ミリリットルの新鮮な肝細胞培養培地を慎重に加え、顕微鏡下で毎日培養物を検査して3~8日間培養器に戻します。3Dコラーゲンサンドイッチ内の原発肝細胞の免疫標識については、各サンドイッチを37°CPBSで慎重に洗浄し、PBSで1ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドを室温で30分間固定します。固定の終わりに、1回の洗浄あたり0.1%Tween 20を補ったPBSの2ミリリットルで10分間皿を3回洗います。
最後の洗浄後、PBSで0.1モルグリシンの1ミリリットルとPBSで0.2%トリトンX-100で細胞を透過させ、PBSとTween 20で3回の洗浄を行います。次に、真空に接続された10マイクロリットルの負荷チップを使用して、コラーゲンの最上層を穏やかに乱し、PBS Tweenで5%ウシ血清アルブミンの1ミリリットルで非特異的結合を2時間ブロックします。インキュベーションの終わりに、各皿にブロッキング溶液に希釈した目的の一次抗体を加え、摂氏37度で一晩インキュベートする。
翌朝、PBS Tweenで15分間の洗浄を3回行い、その後、適切な二次抗体を摂氏37度で5時間標識します。インキュベーションの最後に、PBS Tweenで培養物を2回洗浄し、顕微鏡用アンチフェード実装媒体で皿を取り付ける前に示すように蒸留水で1回洗浄します。3Dコラーゲンサンドイッチに播種してから1日以内に、マウスの原発肝細胞はクラスターを形成し、胆汁カナリクリのほぼ規則的なネットワークで自己組織化しました。
3〜6日以内に、5〜10個の細胞のクラスターは、通常、運河ネットワークを形成する完全分極化肝細胞で観察される。毒素または細胞骨格を変える薬物のいずれかで治療すると、肝細胞細胞骨格および胆汁カナリクリの幅、形状、および数の変化が生じる。エタノール処理はケラチン8の組織に軽度の効果しか示しませんが、胆管幅のトルツと分布が増加します。
ZO-1染色のシグナル強度は、エタノール処理後のタイプ接合の喪失を示唆する未治療の対照と比較して、エタノール処理胆汁カナリクリで減少する。ブレビスタチンによるアトミオシン収縮の阻害は、無秩序な形の、厚い、丸みを帯びた胆汁カナリクリの形成を誘導する。さらに、オカダ酸による処理は、ケラチンの物性に強く影響を与えるホスファターゼを阻害し、未治療のコントロールと比較して著しく狭められる胆汁カナリクリを生じる。
さらに、エタノール処理は、重度の肝細胞損傷を示唆するアラニンおよびアスパラギン酸アミノトランストランスファーゼのレベルを有意に上昇させるが、ブレビスタチン治療はトランスアミン酵素レベルおよびオカダイ酸処理の考慮変化を引き起こすが、アパルギンアミノトランストランス酵素の軽度の生化学的変化を引き起こすが、アスパラギンアミノトランストランス酵素発現の変化はない。カヌレーション中や灌流の開始時に比較的迅速に作業を続け、灌流システムに入る気泡を避けることが重要です。細胞ライセートは、タンパク質発現および/または活性化段階の変化が治療中に起こるかどうかを判断するために、目的のタンパク質の重複ウェルに収集することができます。
