この研究は、小児がん研究基金(CCRF)とNIH R01 AI146009からB.S.Mに資金提供されました。

健康なドナーからの白血病サンプルは、地元の血液銀行から得られた。ここで説明したすべての実験は、機関審査委員会(IRB)によって研究のために免除されると判断され、ミネソタ大学の機関バイオセーフティ委員会(IBC)によって承認されました。
注:すべての実験は、無菌/無菌技術と適切なバイオセーフティレベル2機器で、血液媒介病原体のための普遍的な予防措置に従って行われました。
1. B細胞拡張培地用サプリメントを準備する
<ol><li>1 mg/mLの濃度にCpGオリゴヌクレオチドを再構成する。</li>
	<li>CD40リガンド(CD40L)を100μg/mLの濃度に再構成します。</li>
	<li>組換えヒトIL-10(rhIL-10)を50μg/mLの濃度に再構成する。</li>
	<li>組換えヒトIL-15(rhIL-15)を10μg/mLの濃度に再構成する。 注:各サプリメントを-20°C~-80°Cで6ヶ月間小さなアリコートに保管してください。</li>
</ol>2. 基底培地の準備
<ol><li>B細胞基底培地と5%(v/v)インビトロ免疫細胞拡張用の培地サプリメント(例えば、CTS免疫細胞SR)および1%(v/v)ペニシリンおよびストレプトマイシンを組み合わせます。</li>
	<li>0.22 μmフィルターアダプターを使用して、基底媒体を殺菌ボトルに入れます。</li>
	<li>基底培地を4°Cで1ヶ月以内に保管してください。</li>
</ol>3. B細胞拡張培地の準備
<ol><li>必要量の基底培地を無菌容器に移し、5×10個 の細胞/mLでB細胞を培養する。</li>
	<li>基礎培地に1 μg/mL CPG、100 ng/mL CD40L、50 ng/mL rhIL-10、および10 ng/mL rhIL-15を添加します。</li>
	<li>0.22 μmフィルターを使用して、B細胞拡張培地をフィルター処理します。</li>
	<li>B細胞拡張培地を37°Cで組織培養インキュベーターに平衡化し、使用前に少なくとも30分間湿度を有する5%CO2を用いた。 注意:1日使用する新鮮なB細胞拡張培地を準備してください。B細胞拡張培地を複数日使用する準備 をしないでください 。このメディアレシピは、メモリB細胞および活性化された原発ヒトB細胞の増殖を促進する。</li>
</ol>4. ヒトB細胞の精製と拡張
注:温度制御冷凍容器に99~100%のイソプロピルアルコールを加え、メーカーの指示に従い、凍結容器を4°Cで冷やしてからステップ4.1を開始します。
<ol><li>白血病サンプルからPBMCsを分離する
	<ol>
<li>白血病サンプル(およそ8〜10 mL)を無菌50 mL円錐管に移します。</li>
		<li>滅菌1xリン酸緩衝生理食塩分(PBS)で体積を35 mLに上げる。</li>
		<li>密度勾配培地の15 mLに35 mLの白血病サンプルを慎重に重ねてください。</li>
		<li>ブレーキなしで25分間500×gで遠心分離機、バフィーコート(PBMC層)を邪魔することなくプラズマ層を取り外し、界面からPBMCsを収集し、新しい無菌50 mL円錐形チューブに移します。 </li>
		<li>1x PBS で PBMCs を 50 mL まで持ち出します。</li>
		<li>ブレーキなしで5分間500×gで遠心分離機。PBMCペレットを邪魔することなく上清を除去し、赤色に見えることがあります。</li>
		<li>7 mLの塩化アンモニウム - カリウムリシスバッファーを加え、ピペットを3回よく混合し、室温(RT)で3分間インキュベートします。</li>
		<li>1x PBSでボリュームを50 mLに上げてください。</li>
		<li>400×gで遠心分離機を5分間低抵抗ブレーキで。ペレットを邪魔することなく上清を除去します。ペレットはピンクがかったか白く見えるはずです。 注:分離したばかりのB細胞を培養し続けるには、B細胞の分離を開始する前にB細胞拡張培地を準備します(ステップ4.2)。</li>
	</ol></li>
	<li>ヒトの一次B細胞陰性分離キットを用いたPBMCsからのB細胞分離
	<ol>
<li>分離バッファー内の PBMC を 5 × 107 セル/mL の濃度まで再中断します。 注: PBMCs の総数が 5 × 107 セル 未満の場合は、分離バッファーのボリュームをスケールダウンして、5 × 107 セル/mL を維持します。細胞懸濁液の最小容積および最大容積はそれぞれ0.25 mLおよび8 mLである。</li>
		<li>最大8 mL(5×10個の7 セル/mL)を、キャップ付きの無菌、ポリプロピレン、ラウンドボトムチューブに移します。</li>
		<li>50 μL/mL のカクテルエンハンサーを PBMC に追加します。</li>
		<li>50 μL/mLのアイソレーションカクテルをPBMCに加え、チューブをキャップし、2~3回反転して混ぜます。</li>
		<li>RTで5分間インキュベートします。インキュベーションの4分目 に、少なくとも30sの渦磁気マイクロビーズ。</li>
		<li>PBMCsの1 mLあたり50μLの磁気マイクロビーズを移し、管をキャップし、2〜3回反転して混合します。</li>
		<li>分離バッファーで最大 10 mL を上に置き、ピペットを 2 ~3 回上下に緩やかにします。</li>
		<li>チューブを磁性ステーションに置き、RTで3分間インキュベートします。</li>
		<li>磁石とチューブを一緒に持ち、1つの動きで磁石とチューブを反転させ、セルの懸濁液を新しいチューブに注ぎます。古いチューブを破棄します。</li>
		<li>ステップ 4.2.8 (2 分にインキュベーション時間を短縮) を繰り返し、B 細胞懸濁液をクリーンな円錐形チューブに注ぎます。</li>
		<li>濃縮された B 細胞を使用する準備が整いました。セルがすぐに使用される場合は、セクション 4.3 (ヒト B 細胞拡張) に進みます。フローサイトメトリー(任意)により単離されたB細胞の純度を確認する。セルを使用する前に凍結する場合は、ステップ 4.2.12 に進みます。</li>
		<li>B細胞を凍結させるために、遠心分離機を400×gで5分間、ペレットを乱すことなく上清を捨てる。 </li>
		<li>凍結培地中の細胞を107 個の細胞/mLで再懸濁し、アリコート1 mL/cryovialを再懸濁する。</li>
		<li>冷蔵冷凍容器にクライオビシャルを入れ、一晩で-80°Cで保管します。その後、液体窒素タンクに凍結性の凍結を移します。1年まで凍結細胞を保ちます。 注: 単離された B 細胞の期待収量は、PBMCs 全体の 2%~8% であり、生存率は 95% ~99% です。</li>
	</ol></li>
	<li>ヒトB細胞拡張 注: 分離された新しい B セルを使用する場合は、手順 4.3.1 ~ 4.3.5 を省略してください。細胞を数え、必要な数の細胞を無菌の円錐形チューブに移し、ステップ4.3.6に進みます。<ol>
<li>B細胞を解凍する前に、水浴中の胎児胎児血清(FBS)を前温め。B細胞拡張培地20mLを調製し、T25フラスコに移し、使用前に少なくとも15分前に組織培養インキュベーター(37°C、5%CO2、湿度で)で培地を事前平衡化します。</li>
		<li>37°Cの水浴でB細胞を解凍する。待っている間、2 mLの予温されたFBSを無菌15 mL円錐形管に移す。</li>
		<li>B細胞が完全に解凍された後、すぐにサンプルに1mLの予め温めたFBSを滴下して加えます。RTで1分間インキュベートします。</li>
		<li>ピペットを静かにピペットを使用してサンプルを再中断し、ボリューム全体を、2 mLの予め温めたFBSを含む円錐管にドロップして移動させます。</li>
		<li>滅菌1x PBS、キャップで体積を15 mLに持ち上げ、チューブを2~3回緩やかに反転します。</li>
		<li>400×gで5分間遠心分離機。</li>
		<li>上清を細胞ペレットを乱さずに捨て、あらかじめ平衡化されたB細胞増殖培地の1mLで細胞ペレットを再懸濁し、細胞をカウントする。セルの総数は約 107 個のセルである必要があります。</li>
		<li>細胞を事前平衡化されたB細胞拡張培地の20mLを含むフラスコに移す。細胞の最終的な濃度はおよそ5 x 105 細胞/mLでなければならない。</li>
		<li>フラスコを組織培養インキュベーターで縦にインキュベートします。</li>
		<li>B細胞の全容を無菌の円錐管に移し、ステップ4.3.6~4.3.9を繰り返して、2日ごとに膨張培地を完全にリフレッシュします。 注:T25フラスコは、培地の10〜20 mLを保持することができます。T75フラスコは、最大20~60mLの培地を保持できます。</li>
	</ol></li>
</ol>5. 初発ヒトB細胞工学
<ol><li>B細胞を48±2時間で拡張/活性化して最適な結果を得ます。B細胞膨張培地を調製し、48ウェル組織培養プレートに培地のアリコート1mLを調製し、使用前に少なくとも15分前に組織培養インキュベーターで事前平衡化する。 注: 目的の遺伝子に対応する CRISPR/Cas9 sgRNA を設計する場合は、以下の手順に従ってください。 - オンラインツール11を使用してsgRNAを設計する。 - タンパク質のすべてのアイソフォームに共通のエキソン上にsgRNAを設計します。 - 評判の良い企業から化学修飾sgRNAを注文します。 - sgRNAは通常凍結乾燥した形で来る;滅菌DNase/RNaseフリートリスEDTA(TE)バッファー内のsgRNAを1μg/μLの濃度に再構成します。</li>
	<li>化学修飾されたsgRNAの1 μL(1 μg/μL)を化学修飾 されたレンサ球菌のpyogenes Cas 9(S.p.Cas9)の1回のトランスフェクション反応のヌクレアーゼと混合して、CRISPR/Cas9トランスフェクション基板を調製します。制御のために、sgRNAの代わりに1 μLのTEバッファを使用してください。 注: CD19 sgRNA を遺伝子 KO 実験に使用する場合、結果については 図 2 を参照してください。AAVS1 sgRNAを遺伝子KI実験に使用する場合、結果については 図5 を参照してください。<ul>
<li>すべてのコンポーネントを氷の上に保管してください。</li>
	</ul></li>
	<li>穏やかに混合し、0.2 mL 8管ストリップのチューブに反応ごとにCRISPR / Cas9トランスフェクション基板の2.5 μLを転送します。RTで脇に置きます。</li>
	<li>核の核(エレクトロポレーター)をオンにし、 表1に示すようにトランスフェクション試薬を調製する。 注:これは、必要に応じて、氷の上にすべての試薬を置くことによって、一時停止のための良いステップです。実験を再開する準備ができたら、氷からすべての試薬を取り除きます。S.p. Cas9タンパク質を使用する場合、研究者は、1 μg sgRNAと5 μgのS.P.Cas9タンパク質を混合し、気泡を避け、最適な結果を得る前に少なくとも20分間RTで混合物をインキュベートすることによって、CRISPR/Cas9-sgRNAリボヌクレオタンパク質を事前に複合体化する 必要があります 。</li>
	<li>トランスフェクション反応ごとに106B 細胞を無菌の円錐管に数え、移送する。</li>
	<li>滅菌1x PBSで体積を15 mLに、遠心分離機を400×gで5分間持ち上げる。待ちながら、一次細胞トランスフェクション試薬を準備し(表2)、RTに置いておく。</li>
	<li>細胞ペレットを乱さずに上清を捨てます。</li>
	<li>細胞ペレットを10 mLの無菌1x PBSと遠心分離機を400×gで5分間再懸濁します。</li>
	<li>細胞ペレットを乱さずに上清を完全に捨てます。</li>
	<li>106 B細胞当たり0.5μgの化学修飾GFP mRNA(トランスフェクションレポーターとして)を細胞ペレットに移します(任意)。</li>
	<li>106 B細胞当たり20μL一次細胞トランスフェクション試薬で細胞ペレットを再懸濁する。5~6回ピペットで軽く混ぜます。トランスフェクション反応ごとに20.5 μLを、CRISPR/Cas9トランスフェクション基板の2.5 μLを含む8チューブストリップの0.2 mLチューブに移します。</li>
	<li>ピペットを 1回 上下にして、全ボリューム(23 μL)をトランスフェクションキュベットに混合して転送します。ベンチのキュベットをキャップして軽くタップして、液体がキュベットの底部を覆っていることを確認します。</li>
	<li>トランスフェクターの核形成にヒトの一次B細胞プロトコルを使用する。 注意:核の核(エレクトロポレーター)は、組織培養フードの外側に配置して使用することができます。キュベットをキャップして、滅菌を確実にします。</li>
	<li>RTでキュベットの電気ポレートされた細胞を15分間休まします。</li>
	<li>前平衡化されたB細胞拡張培地の80μLを、キュベット内のトランスフェクション反応に組織培養板から移す。キュベットを組織培養インキュベーターに30分間入れる。</li>
	<li>ピペットを数回軽くピペットし、サンプルの全容をキュベットから混合し、B細胞膨張培地の1mLを含む48ウェル組織培養プレートの適切なウェルに移した。細胞の最終的な濃度は106 細胞/mLでなければなりません。</li>
	<li>遺伝子KI実験を行う場合 、rAAV6ベクターを500,000の感染多重度で、エレクトロポレートされた細胞を含む適切なウェル(約45分後エレクトロポレーション)に移す。 図 4Aの rAAV6 ベクトル・コンストラクトの例を参照してください。 注:例: コントロールサンプルはCRISPR/Cas9またはrAAV6ベクトルなしでエレクトロポレートされます。ベクトルのみのサンプルはCRISPR/Cas9なしで電気ポレートされ、rAAV6ベクターで伝達されます。KIサンプルはCRISPR/Cas9でエレクトロポレートされ、rAAV6ベクターでトランスデューシングされます。rAAV6 は、HDR のターゲット DSB サイトの上および下流に相同性アームを含んでいる必要があります。</li>
	<li>プレートを37°Cの組織培養インキュベーターに入れ、湿度が5%のCO2 を入れる。</li>
	<li>1日目のポストエンジニアリングで細胞を数え、生存率を記録します。</li>
	<li>細胞を数え、きれいな1.5 mLのマイクロ遠心管に細胞の全体の容積を移すことによって、2日ごとにB細胞の膨張媒体をリフレッシュしなさい。400×gで5分間遠心し、ペレットを乱さずに上清を捨てます。100 μLの新鮮な B 細胞拡張培地で細胞を再懸濁し、24 ウェル組織培養プレートのウェルに移します。培地容量を上げて、5×10個の5細胞/mLで最終的な細胞濃度を達成します。 注:48ウェルプレートは、最大1 mLの媒体/ウェルを保持することができます。24ウェルプレートは、最大2 mL培地/ウェルを保持することができます。12ウェルプレートは最大4 mL培地/ウェルを保持でき、6ウェルプレートは最大8 mL培地/ウェルを保持できます。</li>
	<li>流量サイトメトリー解析、TIDE分析、および接合PCRなどのダウンストリーム解析を実行する前に、少なくとも5日間は、操作した細胞を拡張できます。</li>
</ol>

<ol>
	<li>LeBien, T. W., Thomas, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes:+how+they+develop+and+function.">B lymphocytes: how they develop and function.</a> Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).</li><li>Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+antibody-secreting+plasma+cells.">The generation of antibody-secreting plasma cells.</a> Nature Reviews Immunology. 15, 160-171 (2015).</li><li>Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. 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ゲノム編集されたB細胞をM.J.J、K.L.、B.S..Mを発明者として作り、使用する方法に関する特許が出願されています。B.S.Mは、Immusoft Inc.の株式のコンサルタントであり、B.S..Mの研究室で研究を後援しています。

原発ヒトB細胞における精密ゲノム工学は最近9,10まで挑戦されてきた。我々は以前にCRISPR /Cas9を使用して主要なヒトB細胞9を設計するプロトコルを公開していた。ここでは、CD19の効率的なKOまたはノックインEGFPを可能にするB細胞の分離、拡張、およびエンジニアリングのための改良されたプロトコルの概要を説明します。</...

B細胞は造血幹細胞由来のリンパ球系統のサブグループである。彼らは免疫課題に応答して大量の抗体を産生することによって適応体性免疫系において重要な役割を果たす1.B細胞はまた、メモリB細胞および末期分化された、長命の形質細胞の前駆体であり、それによって持続性の液性免疫2を提供する。特に、形質細胞は、何年も何十年も生存しながら特定の抗体を大量に産生する能力において、免疫細胞の中でユニークである3。さらに、末梢血からの分離の容易さは、B細胞系統を新しい細胞ベース療法の優れた候補にする4.
これまで、レンチウイルスベクターや眠れる森の美女トランスポゾンを用いたようなランダムな統合方法は、トランスジーン送達および発現5、6、7、8のB細胞を設計するために使用されてきた。しかし、これらのアプローチの非特異的な性質は、B細胞における特定の遺伝子の生物学的機能を研究することを困難にし、治療環境における挿入突然変異誘発および可変トランスジーン発現および/またはサイレンシングの固有のリスクを伴う。
CRISPR/Cas9システムは、研究者が多くの種の様々な細胞のゲノムを正確に編集することを可能にする強力なゲノム工学ツールです。最近、我々を含む2つのグループは、初原ヒトB細胞9,10のex vivo拡張および標的ゲノム工学の方法の開発に成功している。白血病サンプルから初等ヒトB細胞を精製するプロセスについて説明する。その後、B細胞拡張および単離されたB細胞の活性化のための我々の更新されたプロトコルを説明する。次に、特異的B細胞受容体およびB細胞の特徴である分化19(CD19)のクラスターをノックアウトするプロセスを、活性化B細胞にCRISPR/Cas9 mRNAと共に導入するエレクトロポレーションによって説明する。
Cas9 mRNAは翻訳され、CD19 sgRNAに結合してCRISPR/Cas9-sgRNAリボヌクレオタンパク質複合体(RNP)を形成します。続いて、複合体中のsgRNAはCas9を導き、遺伝子のエキソン2上の標的配列で二本鎖破断(DSB)を作成する。細胞はヌクレオチドを導入または削除することによって「非相同端結合」によってDSBを修復し、フレームシフト突然変異を引き起こし、遺伝子をノックアウトさせる。次に、フローサイトメトリーによるCD19の損失を測定し、分解(TIDE)解析によるインデルの追跡によりインデル形成を解析します。
次に、CRISPR/Cas9を組換えAAV6ベクター(相同性特異的修復(HDR)のドナーテンプレート)と共に使用し、アデノ関連ウイルスインテグレーションサイト1(AAVS1)遺伝子で強化された緑色蛍光タンパク質(EGFP)の部位特異的挿入を仲介するプロセスについて説明する。AAVS1遺伝子は、既知の生物学的機能を持たない活性な遺伝子であり、ヒトゲノム上のAAVウイルス集積部位である。したがって、ゲノム工学の「安全な港」と考えられています。ここでは、B細胞の拡張と活性化により、培養7日間で最大44倍の拡張が可能であることを報告する(図1)。B細胞のエレクトロポレーションは、トランスフェクション後24時間で全体的な細胞健康(図2A)のわずかな減少を示した。CD19マーカーの散布図分析(図2B)は、編集されたセルの83%の減少を示した(図2C)。
クロマトグラフのTIDE分析(図3A)は、インデル%がフローサイトメトリーによる%タンパク質損失と類似していることを明らかにした(図3B)。KI実験のフローサイトメトリー分析は、AAVベクターを受けた細胞(図4)をRNPとともに、最大64%のEGFP陽性細胞(図5A)まで発現し、後に接合ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による積分化に成功したことを示した(図5B)。細胞数は、すべてのサンプルがエンジニアリング後3日以内に迅速に回復したことを示した(図5C)。

<table><tbody><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug</td><td>IDT</td><td>1081059</td><td>smaller size is also available</td></tr><tr><td>Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT)</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer</td><td>Quality Biological</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>CleanCap chemically modified Cas9 mRNA</td><td>Trilink Biotechnology</td><td>L-7206-1000</td><td></td></tr><tr><td>CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg</td><td>Invivogen</td><td>TLRL-2006-5</td><td>different sizes available</td></tr><tr><td>Cryostor CS10, 100 mL</td><td>STEMCELL Technology</td><td>7930</td><td></td></tr><tr><td>CTS Immune Cell SR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A2596101</td><td></td></tr><tr><td>EasySep human B cells isolation kit</td><td>STEMCELL Technology</td><td>17954</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience fixable viability dye eFlour 780</td><td>eBiosciences</td><td>65-0865-14</td><td></td></tr><tr><td>Excellerate B cell media, Xeno-free</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>CCM031</td><td>B-cell basal medium</td></tr><tr><td>Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube</td><td>Corning</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>S11550</td><td>For thawing B cells only</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>GeneMate SnapStrip&amp;reg; 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps</td><td>BioExpress</td><td>T-3035-1 / 490003-692</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS</td><td>GE lifesciences</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Lonza 4D Nucleofector core unit</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002B</td><td></td></tr><tr><td>Lonza 4D Nucleofector X unit</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002X</td><td></td></tr><tr><td>Mega CD40 Ligand</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-522-110-C010</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1562-1EA</td><td>For freezing cells</td></tr><tr><td>Pen/Strep 100X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TMS-AB2-C</td><td></td></tr><tr><td>PerCP anti-human CD19 clone HIB19</td><td>biolegend</td><td>302228</td><td>smaller size is also available</td></tr><tr><td>rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.)</td><td>Vigene Biosciences</td><td>N/A</td><td>large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL</td></tr><tr><td>Recombinant human IL-10 protein 250 ug</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>217-IL-250</td><td>different sizes available</td></tr><tr><td>Recombinant human IL-15 protein 25 ug</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>247-ILB-025</td><td>different sizes available</td></tr><tr><td>The Big Easy EasySep Magnet</td><td>STEMCELL Technology</td><td>18001</td><td>different sizes available</td></tr><tr><td>Tris-EDTA (TE) buffer</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2476100</td><td></td></tr></tbody></table>

genome engineering of primary human b cells using crispr/cas9

B細胞は造血幹細胞由来のリンパ球であり、適応免疫系の体液性アームの重要な構成要素である。彼らは、末梢血からの隔離の容易さ、インビトロでの拡大能力、および生体内での長寿のために、細胞ベースの治療法の魅力的な候補を作ります。また、その通常の生物学的機能は、大量の抗体を産生する—感染と闘う組換え抗体や、エンジモパシーの治療のための酵素など、非常に大量の治療タンパク質を発現するために利用することができる。ここでは、末梢血単核細胞(PBMC)から初代ヒトB細胞を単離し、インビトロで単離されたB細胞を活性化/拡大するための詳細な方法を提供する。次に、B細胞内因性遺伝子の部位特異的KOにCRISPR/Cas9システムを用いたステップを実証する。この方法は、様々な遺伝子の効率的なKOを可能にし、目的の遺伝子の生物学的機能を研究するために使用することができる。次に、B細胞におけるトランスジーン発現カセットの効率的な部位特異的な統合のための組換え、アデノ関連ウイルス(rAAV)ベクターと共にCRISPR/Cas9システムを使用するためのステップを示す。このプロトコルは、遺伝子の生物学的機能を研究し、B細胞治療薬の開発のために、一次ヒトB細胞で使用できるステップバイステップのエンジニアリングプラットフォームを提供します。

更新された拡張および活性化プロトコルにより、7日間でB細胞の急速な拡張が最大44倍になりました(図1;n =3ドナー)。KO実験では、トリパンブルー染色を用いたB細胞数は、24時間のポストエレクトロポレーションでの対照およびCD19 KOサンプルの両方で細胞回収のわずかな減少を伴う80%以上の生存細胞を示した(図2A;p≥0.05、n=3ドナー)。この結果は、エ...

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Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

ここでは、遺伝子ノックアウト(KO)およびノックイン(KI)のプライマリヒトB細胞のCRISPR/Cas9ベースのゲノム工学に関する詳細なステップバイステッププロトコルを提供し、B細胞における遺伝子の生物学的機能とB細胞治療薬の開発を研究します。

CRISPR/Cas9を用いた初等ヒトB細胞のゲノム工学

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

genome-engineering-of-primary-human-b-cells-using-crisprcas9

Research

JoVE Journal

Biology

6.1K ビュー.  University of Minnesota. ここでは、遺伝子ノックアウト(KO)およびノックイン(KI)のプライマリヒトB細胞のCRISPR/Cas9ベースのゲノム工学に関する詳細なステップバイステッププロトコルを提供し、B細胞における遺伝子の生物学的機能とB細胞治療薬の開発を研究します。

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Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to generate RNA-guided nucleases, such as CRISPR-associated (Cas) 9 for site-specific eukaryotic genome editing. Genome engineering by Cas9 is used to efficiently, easily and robustly modify endogenous genes in many biomedically-relevant mammalian cell lines and organisms. Here we show an example of how to utilize the CRISPR/Cas9 methodology to understand the biological function of specific genetic mutations. We model calreticulin (CALR) mutations in murine interleukin-3 (mIL-3) dependent pro-B (Ba/F3) cells by delivery of single guide RNAs (sgRNAs) targeting the endogenous Calr locus in the specific region where insertion and/or deletion (indel) CALR mutations occur in patients with myeloproliferative neoplasms (MPN), a type of blood cancer. The sgRNAs create double strand breaks (DSBs) in the targeted region that are repaired by non-homologous end joining (NHEJ) to give indels of various sizes. We then employ the standard Ba/F3 cellular transformation assay to understand the effect of physiological level expression of Calr mutations on hematopoietic cellular transformation. This approach can be applied to other genes to study their biological function in various mammalian cell lines.

Targeted gene editing using CRISPR/Cas9 has greatly facilitated the understanding of the biological functions of genes. Here, we utilize the CRISPR/Cas9 methodology to model calreticulin mutations in cytokine-dependent hematopoietic cells in order to study their oncogenic activity.

CRISPR/Cas9 を使用して遺伝子変異カルレティキュリン サイトカイン依存性造血細胞での発癌性の活動を調査する編集

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

がん研究

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. Complete gene ablation in HSCs required the generation of knockout mice from which HSCs could be isolated, and gene ablation in primary human HSCs was not possible. Viral transduction could be used for knock-down approaches, but these suffered from variable efficacy. In general, genetic manipulation of human and mouse hematopoietic cells was hampered by low efficiencies and extensive time and cost commitments. Recently, CRISPR/Cas9 has dramatically expanded the ability to engineer the DNA of mammalian cells. However, the application of CRISPR/Cas9 to hematopoietic cells has been challenging, mainly due to their low transfection efficiencies, the toxicity of plasmid-based approaches and the slow turnaround time of virus-based protocols.
A rapid method to perform CRISPR/Cas9-mediated gene editing in murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with knockout efficiencies of up to 90% is provided in this article. This approach utilizes a ribonucleoprotein (RNP) delivery strategy with a streamlined three-day workflow. The use of Cas9-sgRNA RNP allows for a hit-and-run approach, introducing no exogenous DNA sequences in the genome of edited cells and reducing off-target effects. The RNP-based method is fast and straightforward: it does not require cloning of sgRNAs, virus preparation or specific sgRNA chemical modification. With this protocol, scientists should be able to successfully generate knockouts of a gene of interest in primary hematopoietic cells within a week, including downtimes for oligonucleotide synthesis. This approach will allow a much broader group of users to adapt this protocol for their needs.

A protocol for fast CRISPR/Cas9-mediated gene disruption in mouse and human primary hematopoietic cells is described in this article. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins are introduced via electroporation with sgRNAs generated through in vitro transcription and commercial Cas9. High editing efficiencies are achieved with limited time and financial cost.

CRISPR/Cas9 によるマウスおよび人間の造血前駆細胞の高効率遺伝子破壊

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

遺伝学

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been successfully repurposed for genome engineering in many different living organisms. Most commonly, the wildtype CRISPR associated 9 (Cas9) or Cas12a endonuclease is used to cleave specific sites in the genome, after which the DNA double-stranded break is repaired via the non-homologous end joining (NHEJ) pathway or the homology-directed repair (HDR) pathway depending on whether a donor template is absent or present respectively. To date, CRISPR systems from different bacterial species have been shown to be capable of performing genome editing in mammalian cells. However, despite the apparent simplicity of the technology, multiple design parameters need to be considered, which often leave users perplexed about how best to carry out their genome editing experiments. Here, we describe a complete workflow from experimental design to identification of cell clones that carry desired DNA modifications, with the goal of facilitating successful execution of genome editing experiments in mammalian cell lines. We highlight key considerations for users to take note of, including the choice of CRISPR system, the spacer length, and the design of a single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor template. We envision that this workflow will be useful for gene knockout studies, disease modeling efforts, or the generation of reporter cell lines.

CRISPR-Cas is a powerful technology to engineer the complex genomes of plants and animals. Here, we detail a protocol to efficiently edit the human genome using different Cas endonucleases. We highlight important considerations and design parameters to optimize editing efficiency.

CRISPR Cas を用いた哺乳類細胞におけるゲノム編集

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたゲノム修飾の生成

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

原発性骨髄由来マクロファージにおける精密な遺伝子破壊のガイド

High-Efficiency Gene Disruption in Primary Bone Marrow-Derived Macrophages Using Electroporated Cas9-sgRNA Complexes

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) from mice are a key tool for studying the complex biology of tissue macrophages. As primary cells, they model the physiology of macrophages in vivo more closely than immortalized macrophage cell lines and can be derived from mice already carrying defined genetic changes. However, disrupting gene function in BMDMs remains technically challenging. Here, we provide a protocol for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in BMDMs, which allows for the introduction of small insertions and deletions (indels) that result in frameshift mutations that disrupt gene function. The protocol describes how to synthesize single-guide RNAs (sgRNA-Cas9) and form purified sgRNA-Cas9 ribonucleoprotein complexes (RNPs) that can be delivered by electroporation. It also provides an efficient method for monitoring editing efficiency using routine Sanger sequencing and a freely available online analysis program. The protocol can be performed within 1 week and does not require plasmid construction; it typically results in 85% to 95% editing efficiency.

著者スポットライト:骨髄由来マクロファージにおける効率的なCRISPR/Cas9ゲノム編集による正確な遺伝子破壊

This protocol describes the procedure for genome editing in mouse bone marrow-derived macrophages using Cas9-sgRNA ribonucleoprotein complexes assembled in vitro and delivered by electroporation.

エレクトロポレーションCas9-sgRNA複合体を用いた初代骨髄由来マクロファージの高効率遺伝子破壊

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) from mice are a key tool for studying the complex biology of tissue macrophages. As primary cells, they model the ...

Engineering Oncogenic Heterozygous Gain-of-Function Mutations in Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Throughout their lifetime, hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) acquire somatic mutations. Some of these mutations alter HSPC functional properties such as proliferation and differentiation, thereby promoting the development of hematologic malignancies. Efficient and precise genetic manipulation of HSPCs is required to model, characterize, and better understand the functional consequences of recurrent somatic mutations. Mutations can have a deleterious effect on a gene and result in loss-of-function (LOF) or, in stark contrast, may enhance function or even lead to novel characteristics of a particular gene, termed gain-of-function (GOF). In contrast to LOF mutations, GOF mutations almost exclusively occur in a heterozygous fashion. Current genome-editing protocols do not allow for the selective targeting of individual alleles, hampering the ability to model heterozygous GOF mutations. Here, we provide a detailed protocol on how to engineer heterozygous GOF hotspot mutations in human HSPCs by combining CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair and recombinant AAV6 technology for efficient DNA donor template transfer. Importantly, this strategy makes use of a dual fluorescent reporter system to allow for the tracking and purification of successfully heterozygously edited HSPCs. This strategy can be employed to precisely investigate how GOF mutations affect HSPC function and their progression toward hematological malignancies.

Novel strategies to faithfully model somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) are necessary to better study hematopoietic stem cell biology and hematological malignancies. Here, a protocol to model heterozygous gain-of-function mutations in HSPCs by combining the use of CRISPR/Cas9 and dual rAAV donor transduction is described.

ヒト造血幹細胞および前駆細胞における発癌性ヘテロ接合性機能獲得変異の改変

Throughout their lifetime, hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) acquire somatic mutations. Some of these mutations alter HSPC functional ...

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging in primary NK cells. For example, transgene delivery using lentiviral or retroviral transduction resulted in a limited yield of genetically-engineered NK cells due to substantial procedure-associated NK cell apoptosis. We describe here a DNA-free method for genome editing of human primary and expanded NK cells using Cas9 ribonucleoprotein complexes (Cas9/RNPs). This method allowed efficient knockout of the TGFBR2 and HPRT1 genes in NK cells. RT-PCR data showed a significant decrease in gene expression level, and a cytotoxicity assay of a representative cell product suggested that the RNP-modified NK cells became less sensitive to TGF&#946;. Genetically modified cells could be expanded post-electroporation by stimulation with irradiated mbIL21-expressing feeder cells.

Here, we present a protocol to genetically modify primary or expanded human natural killer (NK) cells using Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). By using this protocol, we generated human NK cells deficient for transforming growth factor&#8211;b receptor 2 (TGFBR2) and hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).

Cas9 Ribonucleoproteins を使用してノックアウト プライマリおよび拡張された人間の NK 細胞の生成

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

免疫・感染学

Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with hematological malignancies and are currently being investigated for various solid tumors. CAR-T cells are generated by removing T cells from a patient's blood and engineering them to express a synthetic immune receptor that redirects the T-cells to recognize and eliminate target tumor cells. Gene editing of CAR-T cells has the potential to improve safety of current CAR-T cell therapies and further increase the efficacy of CAR-T cells. Here, we describe methods for the activation, expansion, and characterization of human CRISPR-engineered CD19 directed CAR-T cells. This comprises transduction of the CAR lentiviral vector and use of single guide RNA (sgRNA) and Cas9 endonuclease to target genes of interest in T cells. The methods described in this protocol can be universally applied to other CAR constructs and target genes beyond the ones used for this study. Furthermore, this protocol discusses strategies for gRNA design, lead gRNA selection and target gene knockout validation to reproducibly achieve high-efficiency, multiplex CRISPR-Cas9 engineering of clinical grade human T cells.

Here, we present a protocol for gene editing in primary human T cells using CRISPR Cas Technology to modify CAR-T cells.

CRISPR/Cas9を用いた初等ヒトB細胞のゲノム工学

要約

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CRISPR/Cas9 を使用して遺伝子変異カルレティキュリンサイトカイン依存性造血細胞での発癌性の活動を調査する編集

CRISPR/Cas9 によるマウスおよび人間の造血前駆細胞の高効率遺伝子破壊

CRISPR Cas を用いた哺乳類細胞におけるゲノム編集

ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたゲノム修飾の生成

エレクトロポレーションCas9-sgRNA複合体を用いた初代骨髄由来マクロファージの高効率遺伝子破壊

エレクトロポレーションCas9-sgRNA複合体を用いた初代骨髄由来マクロファージの高効率遺伝子破壊

エレクトロポレーションCas9-sgRNA複合体を用いた初代骨髄由来マクロファージの高効率遺伝子破壊

ヒト造血幹細胞および前駆細胞における発癌性ヘテロ接合性機能獲得変異の改変

Cas9 Ribonucleoproteins を使用してノックアウトプライマリおよび拡張された人間の NK 細胞の生成

ヒトCRISPR設計CAR-T細胞の製造

CRISPR/Cas9を用いた初等ヒトB細胞のゲノム工学

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CRISPR/Cas9 を使用して遺伝子変異カルレティキュリン サイトカイン依存性造血細胞での発癌性の活動を調査する編集

CRISPR/Cas9 によるマウスおよび人間の造血前駆細胞の高効率遺伝子破壊

CRISPR Cas を用いた哺乳類細胞におけるゲノム編集

ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたゲノム修飾の生成

エレクトロポレーションCas9-sgRNA複合体を用いた初代骨髄由来マクロファージの高効率遺伝子破壊

エレクトロポレーションCas9-sgRNA複合体を用いた初代骨髄由来マクロファージの高効率遺伝子破壊

エレクトロポレーションCas9-sgRNA複合体を用いた初代骨髄由来マクロファージの高効率遺伝子破壊

ヒト造血幹細胞および前駆細胞における発癌性ヘテロ接合性機能獲得変異の改変

Cas9 Ribonucleoproteins を使用してノックアウト プライマリおよび拡張された人間の NK 細胞の生成

ヒトCRISPR設計CAR-T細胞の製造

CRISPR/Cas9 を使用して遺伝子変異カルレティキュリンサイトカイン依存性造血細胞での発癌性の活動を調査する編集

Cas9 Ribonucleoproteins を使用してノックアウトプライマリおよび拡張された人間の NK 細胞の生成