本研究室のプロトコルは、ヒトゲノム編集とCAR T細胞療法の組み合わせを可能にします。実験室のプロシージャは高効率の3つまでの遺伝子を標的にするCRISPR-Cas9のアプローチである。そして最後に、私たちのアプローチは、ヒトの臨床試験に翻訳することができます。
記載された方法は、他のCAR構築物および標的遺伝子に適用することができる。この技術の基礎は、より大きな規模に翻訳され、さらなる発展のために学術的および業界の協力者に翻訳されるほど堅牢です。このプロトコルを初めて試す場合は、正確なインキュベーション時間を可能にするために、ガイドRNAスクリーン内のグループ数を制限してください。
記載されているように培養条件と播種密度に従い、私たちの経験において重要であることが証明されています。まず、健康なボランティアドナーから自家末梢血単核細胞(PBMC)を取得し、市販のCD4およびCD8選択キットを使用してCD4およびCD8陽性T細胞を単離する。CD4陽性細胞とCD8陽性T細胞を1対1の比率で組み合わせ、R10で1ミリリットル当たり300万個の細胞をインキュベートし、各ヒトIL7とヒトIL15の1ミリリットル当たり5ナノグラムを摂氏37度で一晩補う。
翌日、T細胞と遠心分離機をGの300倍で500万~1000万個の細胞を5分間数える。すべての上清を捨て、減らされた血清最低の必須媒体で細胞のペレットを洗う。メーカーの指示に従って、100マイクロリットルの核愛情溶液でペレットを再中断します。
細胞を洗浄しながら、リボヌクレオタンパク質、またはRNP複合体を調製し、Cas9ヌクレアーゼの10マイクログラムを室温で10分間10分間単導RNAの5マイクログラムでインキュベートする。単一ガイドRNAを含まないモックコントロールを含む。再懸濁した細胞をRNP複合体と組み合わせ、4マイクロモルエレクトロポレーションエンハンサーの4.2マイクロリットルを加えます。
よく混ぜてエレクトロポレーションキュベットに移します。パルスコードEH111を使用して細胞を電気ポレートし、R10で1ミリリットル当たり500万個の細胞をインキュベートし、12ウェルプレートで48時間摂氏30度で1ミリリットル当たり5ナノグラムを補う。インキュベーション後、T細胞の活性化および拡張を進めます。
標準的なプライマー設計ソフトウェアに PCR アンプリコンのシーケンスを入力して、シーケンシング プライマーを設計します。設計ソフトウェアは、サンガーシーケンシングに適した複数のプライマーシーケンスを提案します。インデルの周りの良好なシーケンシング品質を確保するために、gRNAカット部位の上流または下流の少なくとも150塩基対をアンプリコンと結合する前方および逆プライマーを選択します。
TIDE分析を使用して、ゲノムレベルでのノックアウト効率を検出します。このアルゴリズムは、シーケンストレースからインデルのスペクトルを正確に再構築し、Rの二乗値を計算します。活性化後、T細胞は培養中に拡大され、将来の研究のために凍結保存される。
拡張中、母集団の倍増と体積変化は、モックと編集されたCAR Tセルの両方のプロトコル全体で追跡されます。拡大中の増殖と活性化に有意な変化は検出されなかった。細胞が凍結保存されると、CAR発現のレベルは、モック編集およびノックアウトCAR T細胞の両方のさらなる機能研究のために決定された。
有意な変化は認められない。ノックアウト効率は複数の技術を用いて決定することができる。これらの代表的なフローサイトメトリープロットでは、PDCD1およびTRAC lociを単一ガイドRNAを用いて標的化し、複数の健康なドナー間でのPDCD1単一ガイドRNAに対して90%、TRAC単導路RNAに対して98%の効率を示した。
Cas9とガイドRNAのモル比が正確であることを確認することが重要です。処置の間、細胞は常に摂氏4度に保たれ、長期間エレクトロポレーション溶液に残されてはならない。CAR保存後、CRISPRが設計したCAR T細胞は、細胞毒性アッセイ、サイトカイン産生、および共遺伝学的または異種腫瘍マウスモデルなどのインビトロおよびインビボ機能アッセイに使用できます。
CRISPR Cas9技術を用いた当社のアプローチは、現在臨床試験に応用されています。このアプローチは、世界中の何百万人もの子供と大人に影響を与えるヘモグロビンオファチーなどの非悪性遺伝性疾患と同様に、癌の両方に使用することができます。
