Diese Arbeit wurde vom Children es Cancer Research Fund (CCRF) und NIH R01 AI146009 an B.S.M finanziert.

Leukapherese-Proben von gesunden Spendern wurden von einer lokalen Blutbank erhalten. Alle hier beschriebenen Experimente wurden vom Institutional Review Board (IRB) für die Forschung freigestellt und vom Institutional Biosafety Committee (IBC) der University of Minnesota genehmigt.
HINWEIS: Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit der universellen Vorsichtsmaßnahme für blutübertragene Krankheitserreger, mit sterilen/aseptischen Techniken und ordnungsgemäßen Geräten der Biosicherheitsstufe 2 durchgeführt.
1. Vorbereiten von Ergänzungen für B-Zell-Erweiterungsmedium
<ol><li>CpG-Oligonukleotid auf eine Konzentration von 1 mg/ml rekonstituieren.</li>
	<li>CD40-Ligand (CD40L) auf eine Konzentration von 100 g/ml rekonstituieren.</li>
	<li>Rekonstituieren Sie rekombinantes humanes IL-10 (rhIL-10) auf eine Konzentration von 50 g/ml.</li>
	<li>Rekonstituieren Sie rekombinantes humanes IL-15 (rhIL-15) auf eine Konzentration von 10 g/ml. HINWEIS: Bewahren Sie jeden Zuschlag in kleinen Aliquots bei -20 °C bis -80 °C für bis zu 6 Monate auf.</li>
</ol>2. Vorbereiten von Basalmedium
<ol><li>Kombinieren Sie B-Zell-Basalmedium mit 5% (v/v) Medienergänzung für in vitro Immunzellexpansion (z. B. CTS Immune Cell SR) und 1% (v/v) Penicillin und Streptomycin.</li>
	<li>Filtern Sie das Basalmedium mit einem 0,22 m Filteradapter in eine sterilisierte Flasche.</li>
	<li>Halten Sie das Basalmedium bis zu 1 Monat bei 4 °C.</li>
</ol>3. Vorbereiten von B-Zell-Erweiterungsmedium
<ol><li>Übertragen Sie die benötigte Menge des Basalmediums in einen sterilen Behälter, um die B-Zellen bei 5 × 105 Zellen/ml zu kultitoren.</li>
	<li>Ergänzen Sie das Basalmedium mit 1 g/ml CpG, 100 ng/mL CD40L, 50 ng/mL rhIL-10 und 10 ng/mL rhIL-15.</li>
	<li>Filtern Sie das B-Zell-Erweiterungsmedium mit einem 0,22-mm-Filter.</li>
	<li>Gleichgewichten Sie das B-Zell-Expansionsmedium im Gewebekultur-Inkubator bei 37 °C, 5%CO2 mit Feuchtigkeit für mindestens 30 min vor Gebrauch. HINWEIS: Bereiten Sie frischeS B-Zell-Erweiterungsmedium für einen Tag vor. Bereiten Sie das B-Zell-Erweiterungsmedium nicht für mehrere Tage vor. Dieses Medienrezept fördert die Proliferation von Speicher-B-Zellen und aktivierten primären menschlichen B-Zellen.</li>
</ol>4. Menschliche B-Zell-Reinigung und -Erweiterung
HINWEIS: Fügen Sie 99–100 % Isopropylalkohol nach Anweisung des Herstellers in einen temperaturgeregelten Gefrierbehälter ein, und kühlen Sie den Gefrierbehälter bei 4 °C, bevor Sie Schritt 4.1 starten.
<ol><li>ISolieren von PBMCs aus einer Leukaphoreseprobe
	<ol>
<li>Eine Leukaphoreseprobe (ca. 8–10 ml) in ein steriles 50 ml konisches Rohr übertragen.</li>
		<li>Erhöhen Sie das Volumen auf 35 ml mit steriler 1x Phosphat-gepufferter Saline (PBS).</li>
		<li>Eine 35 ml Leukaphoreseprobe vorsichtig auf 15 ml Dichtegradientenmedium schichten.</li>
		<li>Zentrifuge bei 500 × g für 25 min ohne Bremse, entfernen Sie die Plasmaschicht, ohne die Buffy-Schicht (PBMC-Schicht) zu stören, sammeln Sie die PBMCs von der Schnittstelle und übertragen Sie auf ein neues steriles 50 ml konisches Rohr.</li>
		<li>Bringen Sie die PBMCs mit 1x PBS auf 50 ml hoch.</li>
		<li>Zentrifuge bei 500 × g für 5 min ohne Bremse. Entfernen Sie den Überstand, ohne das PBMC-Pellet zu stören, das rot erscheinen kann.</li>
		<li>7 ml Ammonium-Chlorid-Kalium-Lyse-Puffer hinzufügen, Pipette 3 Mal gut mischen und bei Raumtemperatur (RT) 3 min inkubieren.</li>
		<li>Erhöhen Sie das Volumen auf 50 ml mit 1x PBS.</li>
		<li>Zentrifuge bei 400 × g für 5 min mit widerstandsarmer Bremse. Entfernen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Das Pellet sollte rosa oder weiß aussehen. HINWEIS: Um die frisch isolierten B-Zellen weiter zu kultivieren, bereiten Sie das B-Zell-Erweiterungsmedium vor, bevor Sie mit der B-Zell-Isolierung beginnen (Schritt 4.2).</li>
	</ol></li>
	<li>B-Zell-Isolierung von PBMCs mit humanen primären B-Zell-Negativ-Isolationskit
	<ol>
<li>PBMCs im Isolationspuffer auf eine Konzentration von 5 × 107 Zellen/ml aussetzen. HINWEIS: Wenn die Gesamtzahl der PBMCs kleiner als 5 × 107 Zellen ist, skalieren Sie das Volumen des Isolationspuffers, um 5 × 107 Zellen/ml beizubehalten. Das Mindest- bzw. Höchstvolumen der Zellsuspension beträgt 0,25 ml bzw. 8 ml.</li>
		<li>Bis zu 8 ml (5 × 107 Zellen/ml) in ein steriles, Polypropylen- und Rundbodenrohr mit Kappe geben.</li>
		<li>Fügen Sie den PBMCs 50 l/ml Cocktail Enhancer hinzu.</li>
		<li>Fügen Sie den PBMCs 50 l/ml Isolation Cocktail hinzu, verkappen Sie das Rohr und invertieren Sie 2–3 Mal, um sie zu mischen.</li>
		<li>Inkubieren bei RT für 5 min; in der4. Minute der Inkubation, Wirbel magnetische Mikroperlen für mindestens 30 s.</li>
		<li>Übertragen Sie 50 l magnetische Mikroperlen pro 1 ml PBMCs, kappen Sie das Rohr und invertieren Sie 2-3 Mal, um sie zu mischen.</li>
		<li>Auf- bis zu 10 ml mit Isolationspuffer auf- und sanft pipette auf und ab 2-3 mal auf- und abladen.</li>
		<li>Legen Sie das Rohr in eine Magnetstation und inkubieren Sie bei RT für 3 min.</li>
		<li>Halten Sie den Magneten und das Rohr zusammen und in einer Bewegung den Magneten und das Rohr zusammen, um die Zellsuspension in das neue Rohr zu gießen. Entsorgen Sie die alte Röhre.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 4.2.8 (reduzieren Sie die Inkubationszeit auf 2 min) und gießen Sie die B-Zellsuspension in ein sauberes konisches Rohr.</li>
		<li>Die angereicherten B-Zellen sind einsatzbereit. Wenn Zellen sofort verwendet werden, fahren Sie mit Abschnitt 4.3 (Menschliche B-Zell-Erweiterung) fort. Überprüfen Sie die Reinheit der isolierten B-Zellen durch Durchflusszytometrie (optional). Wenn Zellen vor der Verwendung eingefroren werden sollen, fahren Sie mit Schritt 4.2.12 fort.</li>
		<li>Um die B-Zellen einzufrieren, Zentrifuge bei 400 × g für 5 min, und entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.</li>
		<li>Setzen Sie die Zellen im Gefriermedium bei 107 Zellen/ml und aliquot 1 ml/kryovial aus.</li>
		<li>Den Kryovial in den gekühlten Gefrierbehälter geben und über Nacht bei -80 °C lagern; dann übertragen Sie die gefrorene kryovial in einen flüssigen Stickstofftank; gefroreneNZellen bis zu 1 Jahr aufbewahren. HINWEIS: Die erwartete Ausbeute isolierter B-Zellen beträgt 2 % –8 % der gesamten PBMCs mit einer Lebensfähigkeit von 95 % bis 99 %.</li>
	</ol></li>
	<li>Menschliche B-Zell-Erweiterung HINWEIS: Wenn Sie frisch isolierte B-Zellen verwenden, überspringen Sie die Schritte 4.3.1–4.3.5. Zählen Sie die Zellen und übertragen Sie die erforderliche Anzahl von Zellen in ein steriles konisches Rohr und fahren Sie mit Schritt 4.3.6 fort.<ol>
<li>Vorwarmes fetales Rinderserum (FBS) in einem Wasserbad vor dem Auftauen der B-Zellen. 20 ml B-Zell-Expansionsmedium vorbereiten, vor Gebrauch mindestens 15 min in einen T25-Kolben übertragen und das Medium in einem Gewebekultur-Inkubator (bei 37 °C, 5%CO2, mit Feuchtigkeit) voraussetzen.</li>
		<li>B-Zellen in einem 37 °C-Wasserbad auftauen. Während des Wartens 2 ml vorgewärmter FBS in ein steriles 15 ml konisches Rohr übertragen.</li>
		<li>Nachdem die B-Zellen vollständig aufgetaut sind, fügen Sie sofort 1 ml vorgewärmtes FBS tropfenweise in die Probe ein. Bei RT für 1 min inkubieren.</li>
		<li>Sanfte Pipette, um die Probe wieder auszusetzen und das gesamte Volumen tropfenweise in ein konisches Rohr mit 2 ml vorgewärmtem FBS zu übertragen.</li>
		<li>Erhöhen Sie das Volumen auf 15 ml mit sterilem 1x PBS, Kappe, und invertieren Sie das Rohr vorsichtig 2-3 mal.</li>
		<li>Zentrifuge bei 400 × g für 5 min.</li>
		<li>Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören, setzen Sie das Zellpellet mit 1 ml vorädlibriertem B-Zell-Expansionsmedium wieder auf und zählen Sie die Zellen. Die Gesamtzellenzahl sollte etwa 107 Zellen betragen.</li>
		<li>Übertragen Sie die Zellen in einen Kolben, der 20 ml des vorädlibierten B-Zell-Ausdehnungsmediums enthält. Die Endkonzentration der Zellen sollte etwa 5 x 105 Zellen/ml betragen.</li>
		<li>Inkubieren Sie den Kolben vertikal in einem Gewebekultur-Inkubator.</li>
		<li>Erfrischen Sie das Expansionsmedium alle 2 Tage vollständig, indem Sie das gesamte Volumen der B-Zellen in ein steriles Konusrohr übertragen und die Schritte 4.3.6–4.3.9 wiederholen. HINWEIS: T25-Kolben kann 10–20 ml Medium aufnehmen; Der T75-Kolben kann bis zu 20–60 ml Medium aufnehmen.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Primäres menschliches B-Zell-Engineering
<ol><li>Engineer B-Zellen bei 48 ± 2 h nach Erweiterung/Aktivierung für optimale Ergebnisse. Bereiten Sie das B-Zell-Expansionsmedium, aliquot 1 ml des Mediums in eine 48-Well-Gewebekulturplatte vor und vor dem Einsetzen in einem Gewebekultur-Inkubator vor. HINWEIS: Führen Sie beim Entwerfen einer CRISPR/Cas9 sgRNA für ein Gen von Interesse die unten beschriebenen Schritte aus. - Entwerfen Sie sgRNAs mit einem Online-Tool11. - Design sgRNAs auf einem Exon, das allen Isoformen des Proteins gemeinsam ist. - Bestellen Sie chemisch modifizierte sgRNA von seriösen Unternehmen. - sgRNA kommt in der Regel in lyophilisierter Form; rekonstituieren sgRNA im sterilen DNase/RNase-freien Tris-EDTA (TE)-Puffer bis zu einer Konzentration von 1 g/l.</li>
	<li>Vorbereiten Sie das TRANSfizierungssubstrat CRISPR/Cas9, indem Sie 1 l (1 g/l) chemisch modifizierte sgRNA mit 1,5 l (1 g/l) chemisch modifizierten Streptococcus pyogenes Cas 9 (S.p. Cas9) Nuklease pro Transfektionsreaktion mischen. Verwenden Sie zur Steuerung 1 L TE-Puffer anstelle von sgRNA. HINWEIS: Wenn CD19 sgRNA für ein Gen-KO-Experiment verwendet wird, siehe Abbildung 2 für Ergebnisse. Wenn AAVS1 sgRNA für ein Gen-KI-Experiment verwendet wird, siehe Abbildung 5 für Ergebnisse.<ul>
<li>Halten Sie alle Komponenten auf Eis.</li>
	</ul></li>
	<li>Sanft mischen und 2,5 l CRISPR/Cas9 Transfecting Substrat pro Reaktion in ein Rohr eines 0,2 ml 8-Rohr-Streifens übertragen; bei RT beiseite gelegt werden.</li>
	<li>Schalten Sie einen Nukleofektor (Elektroporator) ein und bereiten Sie Transfektionsreagenzien wie in Tabelle 1dargestellt vor. HINWEIS: Dies ist ein guter Schritt für eine Pause, falls erforderlich, indem alle Reagenzien auf Eis gelegt werden. Entfernen Sie alle Reagenzien vom Eis, wenn Sie bereit sind, das Experiment fortzusetzen. Bei der Verwendung von S.p. Cas9-Protein MUSS der Prüfer den vorkomplexen CRISPR/Cas9-sgRNA-Ribonucleoprotein durch Mischen von 1 g sgRNA mit 5 g S.p. Cas9-Protein, Vermeidung von Blasen und Inkubation der Mischung bei RT für mindestens 20 min vor dem Einsatz für optimale Ergebnisse.</li>
	<li>Zählen und übertragen Sie 106 B Zellen pro Transfektionsreaktion in ein steriles konisches Rohr.</li>
	<li>Erhöhen Sie das Volumen auf 15 ml mit sterilem 1x PBS und Zentrifuge bei 400 × g für 5 min. Während des Wartens das primäre Zelltransfektionsreagenz (Tabelle 2) vorbereiten und bei RT beiseite stellen.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören.</li>
	<li>Das Zellpellet mit 10 ml sterilem 1x PBS und Zentrifuge bei 400 × g für 5 min wieder aufsetzen.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand vollständig, ohne das Zellpellet zu stören.</li>
	<li>Übertragen Sie 0,5 g chemisch modifizierte GFP mRNA (als Transfektionsreporter) pro 106 B Zellen auf das Zellpellet (optional).</li>
	<li>Das Zellpellet mit einem Primärzelltransfektionsreagenz von 20 L pro 106 B-Zellen wieder aufsetzen; 5-6-mal sanft mischen. Übertragen Sie 20,5 l l pro Transfektionsreaktion in das 0,2 ml-Rohr des 8-Rohr-Streifens, der 2,5 l des CRISPR/Cas9-Transfektionssubstrats enthält.</li>
	<li>Einmal nach oben und unten pfeifen, um das gesamte Volumen (23 l) zu mischen und in eine Transfektionsküvette zu übertragen. Kappen und tippen Sie vorsichtig auf die Küvette auf der Bank, um sicherzustellen, dass die Flüssigkeit den Boden der Küvette bedeckt.</li>
	<li>Verwenden Sie menschliches primäres B-Zell-Protokoll auf dem Nukleofektor für die Transfektion. HINWEIS: Der Nukleofektor (Elektroporator) kann platziert und außerhalb der Gewebekulturhaube verwendet werden. Kappen Sie die Küvette, um Sterilität zu gewährleisten.</li>
	<li>Die elektropolierten Zellen in der Küvette bei RT 15 min ruhen.</li>
	<li>Übertragen Sie 80 l des vorädierten B-Zell-Expansionsmediums von der Gewebekulturplatte in die Transfektionsreaktion in der Küvette. Die Küvette 30 min im Inkubator der Gewebekultur unterbringen.</li>
	<li>Ein paar Mal sanft Pipette mischen und das gesamte Volumen der Probe von der Küvette in einen geeigneten Brunnen einer 48-Well-Gewebekulturplatte mit 1 ml des B-Zell-Expansionsmediums übertragen. Die Endkonzentration der Zellen sollte 106 Zellen/ml betragen.</li>
	<li>Wenn Sie ein Gen-KI-Experiment durchführen, übertragen Sie den rAAV6-Vektor bei 500.000 Infektionsvielfalt in den entsprechenden Brunnen, der elektroporated Zellen enthält (ca. 45 min nach der Elektroporation). Siehe Beispiel rAAV6 Vektorkonstrukt in Abbildung 4A. HINWEIS: Zum Beispiel: Ein Steuermuster wird ohne CRISPR/Cas9 oder den rAAV6-Vektor elektropoiert. Eine reine Vektorprobe wird ohne CRISPR/Cas9 elektropoiert und dann mit dem rAAV6-Vektor transduziert. Eine KI-Probe wird mit CRISPR/Cas9 elektropoiert und dann mit dem rAAV6-Vektor transduziert. rAAV6 muss Homologiearme nach oben und unterhalb des Ziel-DSB-Standorts für HDR enthalten.</li>
	<li>Legen Sie die Platte in einen Gewebekultur-Inkubator bei 37 °C und 5%CO2 mit Feuchtigkeit.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellen und zeichnen Sie die Lebensfähigkeit am tag 1 nach dem Engineering auf.</li>
	<li>Erfrischen Sie das B-Zell-Expansionsmedium alle 2 Tage, indem Sie die Zellen zählen und dann das gesamte Volumen der Zellen in ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr übertragen. Zentrifugieren Sie bei 400 × g für 5 min, und entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Setzen Sie die Zellen mit 100 l frischem B-Zell-Expansionsmedium aus und übertragen Sie sie auf einen Brunnen einer 24-Well-Gewebekulturplatte. Bringen Sie das mittlere Volumen auf, um eine endgültige Zellkonzentration bei 5 × 105 Zellen/ml zu erreichen. HINWEIS: Eine 48-Well-Platte kann bis zu 1 ml Medium/Well aufnehmen; eine 24-Well-Platte kann bis zu 2 ml Mittel/Gut aufnehmen; eine 12-Well-Platte kann bis zu 4 ml Mittel/Well aufnehmen, und eine 6-Well-Platte kann bis zu 8 ml Medium/Well aufnehmen.</li>
	<li>Erlauben Sie den entwickelten Zellen, sich für mindestens 5 Tage zu erweitern, bevor Sie nachgelagerte Analysen durchführen, z. B. für die Analyse der Durchflusszytometrie, die TIDE-Analyse und die Anschluss-PCR.</li>
</ol>

<ol>
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Es wurde ein Patent über die Methoden der Herstellung und Verwendung genombearbeiteter B-Zellen mit M.J.J,K.L. und B.S.M als Erfinder eingereicht. B.S.M ist Berater für immusoft Inc. Immusoft Inc. Immusoft Inc. hat Forschung im Labor von B.S.M gesponsert.

Präzise Genom-Engineering in primären menschlichen B-Zellen war bis vor kurzem eine Herausforderung9,10. Wir hatten zuvor Protokolle veröffentlicht, die CRISPR/Cas9 verwenden, um primäre menschliche B-Zellen9zu entwickeln. Hier skizzieren wir verbesserte Protokolle für B-Zell-Isolation, -Erweiterung und -Engineering, um eine effiziente KO von CD19 oder einKnock-in EGFPzu ermöglichen.
Hier zeigen w...

B-Zellen sind eine Untergruppe der Lymphozytenlinie, die aus hämatopoetischen Stammzellen abgeleitet wird. Sie spielen eine entscheidende Rolle im adaptiven humoralen Immunsystem, indem sie große Mengen an Antikörpern als Reaktion auf Immunherausforderungen produzieren1. B-Zellen sind auch Vorläufer von Gedächtnis-B-Zellen und den endlos differenzierten, langlebigen Plasmazellen und bieten so eine dauerhafte humorale Immunität2. Insbesondere Plasmazellen sind einzigartig unter Immunzellen in ihrer Fähigkeit, große Mengen eines bestimmten Antikörpers zu produzieren, während sie über Jahre oder Jahrzehnte überleben3. Darüber hinaus macht die einfache Isolierung von peripherem Blut die B-Zell-Linie zu einem ausgezeichneten Kandidaten für neuartige zellbasierte Therapien4.
Bisher wurden zufällige Integrationsmethoden, wie z. B. mit lentiviralen Vektoren oder einem Sleeping Beauty-Transposon, verwendet, um B-Zellen für die Transgenabgabe und Expression5,6,7,8zu entwickeln. Die Unspezifische Natur dieser Ansätze erschwert jedoch die Untersuchung der biologischen Funktionen eines bestimmten Gens in den B-Zellen und birgt ein inhärentes Risiko einer Insertionsmutagenese und einer variablen Transgenexpression und/oder Silencing in der therapeutischen Umgebung.
Das CRISPR/Cas9-System ist ein leistungsfähiges Genom-Engineering-Tool, mit dem Forscher das Genom verschiedener Zellen in zahlreichen Arten präzise bearbeiten können. Kürzlich haben zwei Gruppen, darunter unsere eigene, erfolgreich Methoden zur Ex-vivo-Expansion und gezielte Genom-Engineering von primären menschlichen B-Zellen9,10entwickelt. Wir werden den Prozess der Reinigung primärer menschlicher B-Zellen aus einer Leukaphoreseprobe beschreiben. Danach beschreiben wir unser aktualisiertes Protokoll zur B-Zell-Erweiterung und Aktivierung isolierter B-Zellen. Wir beschreiben dann ein Verfahren zum Ausklopfen des Differenzierungsclusters 19 (CD19), eines spezifischen B-Zell-Rezeptors und eines Kennzeichens von B-Zellen, durch Elektroporation, um CRISPR/Cas9 mRNA zusammen mit CD19 sgRNA in aktivierte B-Zellen einzuführen.
Cas9 mRNA wird übersetzt und bindet an die CD19 sgRNA zu einem CRISPR/Cas9-sgRNA Ribonukleoprotein-Komplex (RNP). Anschließend führt sgRNA im Komplex Cas9 zu Doppelstrangbruch (DSB) an der Zielsequenz auf Exon 2 des Gens. Die Zellen reparieren das DSB durch "nicht-homologe Endverbindung" durch Die Einführung oder Löschung von Nukleotiden, was zu Frameshift-Mutationen führt und dazu führt, dass das Gen ausgeschlagen wird. Wir messen dann den Verlust von CD19 durch Strömungszytometrie und analysieren die Indelbildung, indem wir Indels durch Zersetzungsanalyse (TIDE) verfolgen.
Wir beschreiben dann den Prozess der Verwendung von CRISPR/Cas9 zusammen mit einem rekombinanten AAV6-Vektor (rAAV6, eine Spendervorlage für homologiegesteuerte Reparatur (HDR)), um die standortspezifische Einfügung von verbessertem grünem Fluoreszenzprotein(EGFP) an der adeno-assoziierten Virusintegrationsstelle 1 (AAVS1) zu vermitteln. Das AAVS1-Gen ist ein aktiver Ort ohne bekannte biologische Funktionen und eine AAV-Virusintegrationsstelle im menschlichen Genom; Daher gilt es als "sicherer Hafen" für die Genomtechnik. Hier berichten wir, dass die Erweiterung und Aktivierung von B-Zellen eine bis zu 44-fache Expansion in 7 Tagen Kultur ermöglichte (Abbildung 1). Die Elektroporation von B-Zellen zeigte eine leichte Reduktion der allgemeinen Zellgesundheit (Abbildung 2A) bei 24 h nach der Transfektion. Die Streudiagrammanalyse des CD19-Markers (Abbildung 2B) zeigte eine Reduktion der bearbeiteten Zellen um bis zu 83 % (Abbildung 2C).
Die TIDE-Analyse der Chromatographen (Abbildung 3A) ergab, dass die % indels dem % Proteinverlust durch Durchflusszytometrie ähnelten (Abbildung 3B). Die Durchflusszytometrie-Analyse des KI-Experiments zeigte, dass die Zellen, die den AAV-Vektor erhielten (Abbildung 4), zusammen mit RNP bis zu 64% EGFP-positive Zellen exprimierten (Abbildung 5A) und später eine erfolgreiche Integration durch Junction-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zeigten (Abbildung 5B). Die Anzahl der Zellen zeigte, dass sich alle Proben innerhalb von 3 Tagen nach dem Engineering schnell erholten (Abbildung 5C).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug</td>
			<td>IDT</td>
			<td>1081059</td>
			<td>smaller size is also available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>V4XP-3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>118-156-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanCap chemically modified Cas9 mRNA</td>
			<td>Trilink Biotechnology</td>
			<td>L-7206-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>TLRL-2006-5</td>
			<td>different sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10, 100 mL</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>7930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS Immune Cell SR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2596101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep human B cells isolation kit</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>17954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience fixable viability dye eFlour 780</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excellerate B cell media, Xeno-free</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>CCM031</td>
			<td>B-cell basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>S11550</td>
			<td>For thawing B cells only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMate SnapStrip&#174; 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>T-3035-1 / 490003-692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS</td>
			<td>GE lifesciences</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lonza 4D Nucleofector core unit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lonza 4D Nucleofector X unit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1002X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mega CD40 Ligand</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-522-110-C010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1562-1EA</td>
			<td>For freezing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep 100X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TMS-AB2-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP anti-human CD19 clone HIB19</td>
			<td>biolegend</td>
			<td>302228</td>
			<td>smaller size is also available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.)</td>
			<td>Vigene Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-10 protein 250 ug</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>217-IL-250</td>
			<td>different sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-15 protein 25 ug</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>247-ILB-025</td>
			<td>different sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Big Easy EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>18001</td>
			<td>different sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA (TE) buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2476100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome engineering of primary human b cells using crispr/cas9

B-Zellen sind Lymphozyten, die aus hämatopoetischen Stammzellen gewonnen werden und ein wichtiger Bestandteil des humoralen Arms des adaptiven Immunsystems sind. Sie machen attraktive Kandidaten für zellbasierte Therapien wegen ihrer einfachen Isolation von peripherem Blut, ihrer Fähigkeit, sich in vitro auszudehnen, und ihrer Langlebigkeit in vivo. Darüber hinaus kann ihre normale biologische Funktion – zur Produktion großer Mengen von Antikörpern – genutzt werden, um sehr große Mengen eines therapeutischen Proteins auszudrücken, wie z. B. einen rekombinanten Antikörper zur Bekämpfung von Infektionen oder ein Enzym zur Behandlung von Enzymopathien. Hier bieten wir detaillierte Methoden zur Isolierung primärer menschlicher B-Zellen aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) und zur Aktivierung/Erweiterung isolierter B-Zellen in vitro. Anschließend zeigen wir die Schritte zur Verwendung des CRISPR/Cas9-Systems für standortspezifische KO endogene Gene in B-Zellen. Diese Methode ermöglicht effizienteko verschiedener Gene, die verwendet werden können, um die biologischen Funktionen von Genen von Interesse zu studieren. Anschließend zeigen wir die Schritte zur Verwendung des CRISPR/Cas9-Systems zusammen mit einem rekombinanten, adeno-assoziierten, viralen (rAAV) Vektor für eine effiziente standortspezifische Integration einer transgenen Expressionskassette in B-Zellen. Zusammen bietet dieses Protokoll eine Schritt-für-Schritt-Engineering-Plattform, die in primären menschlichen B-Zellen verwendet werden kann, um biologische Funktionen von Genen sowie für die Entwicklung von B-Zell-Therapeutika zu untersuchen.

Das aktualisierte Erweiterungs- und Aktivierungsprotokoll ermöglichte eine schnelle Expansion von B-Zellen bis zum 44-fachen in 7 Tagen(Abbildung 1; n =3 Spender). Im KO-Experiment zeigte die B-Zellzahl mit Trypan-Blaufärbung mehr als 80% lebensfähige Zellen mit einer leichten Reduktion der Zellrückgewinnung sowohl bei der Kontrolle als auch bei den CD19 KO-Proben bei 24 h Nachelektroporation(Abbildung 2A;p ≥ 0,05, n = 3 Spender). Dieses Ergebnis zeigt, da...

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Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

Hier stellen wir ein detailliertes, schrittweises Protokoll für die CRISPR/Cas9-basierte Genom-Engineering von primären menschlichen B-Zellen für Gen Knockout (KO) und Knock-in (KI) zur Untersuchung der biologischen Funktionen von Genen in B-Zellen und der Entwicklung von B-Zell-Therapeutika zur Verfügung.

Genom-Engineering von primären menschlichen B-Zellen mit CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

genome-engineering-of-primary-human-b-cells-using-crisprcas9

Research

JoVE Journal

Biology

6.1K Aufrufe.  University of Minnesota. Hier stellen wir ein detailliertes, schrittweises Protokoll für die CRISPR/Cas9-basierte Genom-Engineering von primären menschlichen B-Zellen für Gen Knockout (KO) und Knock-in (KI) zur Untersuchung der biologischen Funktionen von Genen in B-Zellen und der Entwicklung von B-Zell-Therapeutika zur Verfügung.

Serie: Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

Gross und Fine Dissection of Inner Ear Sinnesepithelien in Adult Zebrafisch ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Forschung

Biologie

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

Generation of Human CD40-aktivierten B-Zellen

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Over the last decade, several adult stem cell populations have been identified in human skin 1-4. The isolation of multipotent adult dermal precursors was first reported by Miller F. D laboratory 5, 6. These early studies described a multipotent precursor cell population from adult mammalian dermis 5. These cells--termed SKPs, for skin-derived precursors-- were isolated and expanded from rodent and human skin and differentiated into both neural and mesodermal progeny, including cell types never found in skin, such as neurons 5. Immunocytochemical studies on cultured SKPs revealed that cells expressed vimentin and nestin, an intermediate filament protein expressed in neural and skeletal muscle precursors, in addition to fibronectin and multipotent stem cell markers 6. Until now, the adult stem cells population SKPs have been isolated from freshly collected mammalian skin biopsies.
Recently, we have established and reported that a population of skin derived precursor cells could remain present in primary fibroblast cultures established from skin biopsies 7. The assumption that a few somatic stem cells might reside in primary fibroblast cultures at early population doublings was based upon the following observations: (1) SKPs and primary fibroblast cultures are derived from the dermis, and therefore a small number of SKP cells could remain present in primary dermal fibroblast cultures and (2) primary fibroblast cultures grown from frozen aliquots that have been subjected to unfavorable temperature during storage or transfer contained a small number of cells that remained viable 7. These rare cells were able to expand and could be passaged several times. This observation suggested that a small number of cells with high proliferation potency and resistance to stress were present in human fibroblast cultures 7.
We took advantage of these findings to establish a protocol for rapid isolation of adult stem cells from primary fibroblast cultures that are readily available from tissue banks around the world (Figure 1). This method has important significance as it allows the isolation of precursor cells when skin samples are not accessible while fibroblast cultures may be available from tissue banks, thus, opening new opportunities to dissect the molecular mechanisms underlying rare genetic diseases as well as modeling diseases in a dish.

Na&#239;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

We report a method to isolate na&#239;ve multipotent skin-derived precursor (SKP) cells from primary human fibroblast cultures. We show that these SKPs derived from fibroblast cultures share similar stem cell properties to the ones derived directly from human skin biopsies. These cells express the neural crest marker, nestin, in addition to the multipotent markers such as OCT4 and Nanog.

Naive Adult Stem Cells Isolation von primären humanen Fibroblasten Kulturen

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

In Vivo Modellierung des Morbid Human Genome mit Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well as for modeling human diseases and testing therapeutic strategies. Recent advances in the use of designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system for site-specific genome engineering open the possibility to perform rapid targeted genome modification in virtually any laboratory species without the need to rely on embryonic stem (ES) cell technology. A genome editing experiment typically starts with identification of designer nuclease target sites within a gene of interest followed by construction of custom DNA-binding domains to direct nuclease activity to the investigator-defined genomic locus. Designer nuclease plasmids are in vitro transcribed to generate mRNA for microinjection of fertilized mouse oocytes. Here, we provide a protocol for achieving targeted genome modification by direct injection of TALEN mRNA into fertilized mouse oocytes.

Designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs) and transcription activator-like effector nucleases (TALENs) can be used to modify the genome of mouse preimplantation embryos by triggering both the nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR) pathways. These advances enable the rapid generation of mice with precise genetic modifications.

Maus-Genom-Engineering mit Designer Nukleasen

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory cells, EC cells sense luminal stimuli and convert them into serotonin (5-hyroxytryptamine, 5-HT) release events. However, the electrophysiology of these cells is poorly understood because they are difficult to culture and to identify. The method presented in this paper outlines primary EC cell cultures optimized for single cell electrophysiology. This protocol utilizes a transgenic cyan fluorescent protein (CFP) reporter to identify mouse EC cells in mixed primary cultures, advancing the approach to obtaining high-quality recordings of whole cell electrophysiology in voltage- and current-clamp modes.

Enterochromaffin (EC) cells comprise a small subset of gastrointestinal epithelial cells. EC cells are electrically excitable and release serotonin, yet difficulties in culturing and identifying EC cells have limited physiological studies. The method presented here establishes a primary culture model amenable to examination of single EC cells by electrophysiology.

Ganze Zelle Elektrophysiologie des primären kultivierten murinen Enterochromaffinen Zellen

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory ...

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the JDP family could form transient heterocomplexes in eukaryotes to fine-tune substrate selection for the 70 kDa heat shock protein (Hsp70) chaperone-based protein disaggregases. The JDP complexes target acute/chronic stress induced aggregated proteins and presumably help assemble the disaggregases by recruiting multiple Hsp70s to the surface of protein aggregates. The extent of the protein quality control (PQC) network formed by these physically interacting JDPs remains largely uncharacterized in vivo. Here, we describe a microscopy-based in situ protein interaction assay named the proximity ligation assay (PLA), which is able to robustly capture&#160;these transiently formed chaperone complexes in distinct cellular compartments of eukaryotic cells. Our work expands the employment of PLA from human cells to yeast (Saccharomyces cerevisiae) and bacteria (Escherichia coli), thus rendering an important tool to monitor the dynamics of transiently formed protein assemblies in both prokaryotic and eukaryotic cells.

Cognate J-domain proteins cooperate with the Hsp70 chaperone to assist in a myriad of biological processes ranging from protein folding to degradation. Here, we describe an in situ proximity ligation assay, which allows the monitoring of these transiently formed chaperone machineries in bacterial, yeast and human cells.

In Situ-Überwachung von transient gebildeten molekularen Chaperon-Baugruppen in Bakterien, Hefe und menschlichen Zellen

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these independently derived phenotypes, which share a common genetic architecture. This is perhaps best exemplified by the numerous convergent features of gymnotiforms and mormyrids, two species-rich teleost clades that produce and detect weak electric fields and are called weakly electric fish. In the 50 years since the discovery that weakly electric fish use electricity to sense their surroundings and communicate, a growing community of scientists has gained tremendous insights into evolution of development, systems and circuits neuroscience, cellular physiology, ecology, evolutionary biology, and behavior. More recently, there has been a proliferation of genomic resources for electric fish. Use of these resources has already facilitated important insights with regards to the connection between genotype and phenotype in these species. A major obstacle to integrating genomics data with phenotypic data of weakly electric fish is a present lack of functional genomics tools. We report here a full protocol for performing CRISPR/Cas9 mutagenesis that utilizes endogenous DNA repair mechanisms in weakly electric fish. We demonstrate that this protocol is equally effective in both the mormyrid species Brienomyrus brachyistius and the gymnotiform Brachyhypopomus gauderio by using CRISPR/Cas9 to target indels and point mutations in the first exon of the sodium channel gene scn4aa. Using this protocol, embryos from both species were obtained and genotyped to confirm that the predicted mutations in the first exon of the sodium channel scn4aa were present. The knock-out success phenotype was confirmed with recordings showing reduced electric organ discharge amplitudes when compared to uninjected size-matched controls.

Here, a protocol is presented to produce and rear CRISPR/Cas9 genome knockout electric fish. Outlined in detail are the required molecular biology, breeding, and husbandry requirements for both a gymnotiform and a mormyrid, and injection techniques to produce Cas9-induced indel F0 larvae.

Den Funken zum Schweigen bringen: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by filarial nematodes such as canine heartworm and elephantasis. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been used to induce site-directed mutations by injecting a Cas9 protein that has been complexed with a guide RNA (gRNA) into freshly laid embryos of several insect species, including mosquitoes that belong to the genera Anopheles and Aedes. Manipulating and injecting Culex mosquitoes is slightly more difficult as these mosquitoes lay their eggs upright in rafts rather than individually like other species of mosquitoes. Here we describe how to design gRNAs, complex them with Cas9 protein, induce female mosquitoes of Culex pipiens to lay eggs, and how to prepare and inject newly laid embryos for microinjection with Cas9/gRNA. We also describe how to rear and screen injected mosquitoes for the desired mutation. The representative results demonstrate that this technique can be used to induce site-directed mutations in the genome of Culex mosquitoes and, with slight modifications, can be used to generate null-mutants in other mosquito species as well.&#160;

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is increasingly used to characterize gene function in non-model organisms. This protocol describes how to generate knock-out lines of Culex pipiens, from preparing injection mixes, to obtaining and injecting mosquito embryos, as well as how to rear, cross, and screen injected mosquitoes and their progeny for desired mutations.

Vorbereitung und Injektion von Embryonen von Culex-Moskitos zur Erzeugung von Nullmutationen mit CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an important research model for insect metamorphosis. The CRISPR/Cas9 system can accurately locate at a specific DNA locus and cleave within the target site, efficiently introducing double-strand breaks to induce target gene knockout or integrate new gene fragments into the specific locus. CRISPR/Cas9-mediated genome editing is a powerful tool for addressing questions encountered in locust research as well as a promising technology for locust control. This study provides a systematic protocol for CRISPR/Cas9-mediated gene knockout with the complex of Cas9 protein and single guide RNAs (sgRNAs) in migratory locusts. The selection of target sites and design of sgRNA are described in detail, followed by in vitro synthesis and verification of the sgRNAs. Subsequent procedures include egg raft collection and tanned-egg separation to achieve successful microinjection with low mortality rate, egg culture,&#160;preliminary estimation of the mutation rate, locust breeding as well as detection, preservation, and passage of the mutants to ensure population stability of the edited locusts. This method can be used as a reference for CRISPR/Cas9 based gene editing applications in migratory locusts as well as in other insects.

This study provides a systematically optimized procedure of CRISPR/Cas9 ribonuclease-based construction of homozygous locust mutants as well as a detailed method for cryopreservation and resuscitation of the locust eggs.

Konstruktion homozygoter Mutanten der Wanderheuschrecke mittels CRISPR/Cas9-Technologie

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...