Diese Arbeit wurde vom Children es Cancer Research Fund (CCRF) und NIH R01 AI146009 an B.S.M finanziert.

Leukapherese-Proben von gesunden Spendern wurden von einer lokalen Blutbank erhalten. Alle hier beschriebenen Experimente wurden vom Institutional Review Board (IRB) für die Forschung freigestellt und vom Institutional Biosafety Committee (IBC) der University of Minnesota genehmigt.
HINWEIS: Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit der universellen Vorsichtsmaßnahme für blutübertragene Krankheitserreger, mit sterilen/aseptischen Techniken und ordnungsgemäßen Geräten der Biosicherheitsstufe 2 durchgeführt.
1. Vorbereiten von Ergänzungen für B-Zell-Erweiterungsmedium
<ol><li>CpG-Oligonukleotid auf eine Konzentration von 1 mg/ml rekonstituieren.</li>
	<li>CD40-Ligand (CD40L) auf eine Konzentration von 100 g/ml rekonstituieren.</li>
	<li>Rekonstituieren Sie rekombinantes humanes IL-10 (rhIL-10) auf eine Konzentration von 50 g/ml.</li>
	<li>Rekonstituieren Sie rekombinantes humanes IL-15 (rhIL-15) auf eine Konzentration von 10 g/ml. HINWEIS: Bewahren Sie jeden Zuschlag in kleinen Aliquots bei -20 °C bis -80 °C für bis zu 6 Monate auf.</li>
</ol>2. Vorbereiten von Basalmedium
<ol><li>Kombinieren Sie B-Zell-Basalmedium mit 5% (v/v) Medienergänzung für in vitro Immunzellexpansion (z. B. CTS Immune Cell SR) und 1% (v/v) Penicillin und Streptomycin.</li>
	<li>Filtern Sie das Basalmedium mit einem 0,22 m Filteradapter in eine sterilisierte Flasche.</li>
	<li>Halten Sie das Basalmedium bis zu 1 Monat bei 4 °C.</li>
</ol>3. Vorbereiten von B-Zell-Erweiterungsmedium
<ol><li>Übertragen Sie die benötigte Menge des Basalmediums in einen sterilen Behälter, um die B-Zellen bei 5 × 105 Zellen/ml zu kultitoren.</li>
	<li>Ergänzen Sie das Basalmedium mit 1 g/ml CpG, 100 ng/mL CD40L, 50 ng/mL rhIL-10 und 10 ng/mL rhIL-15.</li>
	<li>Filtern Sie das B-Zell-Erweiterungsmedium mit einem 0,22-mm-Filter.</li>
	<li>Gleichgewichten Sie das B-Zell-Expansionsmedium im Gewebekultur-Inkubator bei 37 °C, 5%CO2 mit Feuchtigkeit für mindestens 30 min vor Gebrauch. HINWEIS: Bereiten Sie frischeS B-Zell-Erweiterungsmedium für einen Tag vor. Bereiten Sie das B-Zell-Erweiterungsmedium nicht für mehrere Tage vor. Dieses Medienrezept fördert die Proliferation von Speicher-B-Zellen und aktivierten primären menschlichen B-Zellen.</li>
</ol>4. Menschliche B-Zell-Reinigung und -Erweiterung
HINWEIS: Fügen Sie 99–100 % Isopropylalkohol nach Anweisung des Herstellers in einen temperaturgeregelten Gefrierbehälter ein, und kühlen Sie den Gefrierbehälter bei 4 °C, bevor Sie Schritt 4.1 starten.
<ol><li>ISolieren von PBMCs aus einer Leukaphoreseprobe
	<ol>
<li>Eine Leukaphoreseprobe (ca. 8–10 ml) in ein steriles 50 ml konisches Rohr übertragen.</li>
		<li>Erhöhen Sie das Volumen auf 35 ml mit steriler 1x Phosphat-gepufferter Saline (PBS).</li>
		<li>Eine 35 ml Leukaphoreseprobe vorsichtig auf 15 ml Dichtegradientenmedium schichten.</li>
		<li>Zentrifuge bei 500 × g für 25 min ohne Bremse, entfernen Sie die Plasmaschicht, ohne die Buffy-Schicht (PBMC-Schicht) zu stören, sammeln Sie die PBMCs von der Schnittstelle und übertragen Sie auf ein neues steriles 50 ml konisches Rohr.</li>
		<li>Bringen Sie die PBMCs mit 1x PBS auf 50 ml hoch.</li>
		<li>Zentrifuge bei 500 × g für 5 min ohne Bremse. Entfernen Sie den Überstand, ohne das PBMC-Pellet zu stören, das rot erscheinen kann.</li>
		<li>7 ml Ammonium-Chlorid-Kalium-Lyse-Puffer hinzufügen, Pipette 3 Mal gut mischen und bei Raumtemperatur (RT) 3 min inkubieren.</li>
		<li>Erhöhen Sie das Volumen auf 50 ml mit 1x PBS.</li>
		<li>Zentrifuge bei 400 × g für 5 min mit widerstandsarmer Bremse. Entfernen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Das Pellet sollte rosa oder weiß aussehen. HINWEIS: Um die frisch isolierten B-Zellen weiter zu kultivieren, bereiten Sie das B-Zell-Erweiterungsmedium vor, bevor Sie mit der B-Zell-Isolierung beginnen (Schritt 4.2).</li>
	</ol></li>
	<li>B-Zell-Isolierung von PBMCs mit humanen primären B-Zell-Negativ-Isolationskit
	<ol>
<li>PBMCs im Isolationspuffer auf eine Konzentration von 5 × 107 Zellen/ml aussetzen. HINWEIS: Wenn die Gesamtzahl der PBMCs kleiner als 5 × 107 Zellen ist, skalieren Sie das Volumen des Isolationspuffers, um 5 × 107 Zellen/ml beizubehalten. Das Mindest- bzw. Höchstvolumen der Zellsuspension beträgt 0,25 ml bzw. 8 ml.</li>
		<li>Bis zu 8 ml (5 × 107 Zellen/ml) in ein steriles, Polypropylen- und Rundbodenrohr mit Kappe geben.</li>
		<li>Fügen Sie den PBMCs 50 l/ml Cocktail Enhancer hinzu.</li>
		<li>Fügen Sie den PBMCs 50 l/ml Isolation Cocktail hinzu, verkappen Sie das Rohr und invertieren Sie 2–3 Mal, um sie zu mischen.</li>
		<li>Inkubieren bei RT für 5 min; in der4. Minute der Inkubation, Wirbel magnetische Mikroperlen für mindestens 30 s.</li>
		<li>Übertragen Sie 50 l magnetische Mikroperlen pro 1 ml PBMCs, kappen Sie das Rohr und invertieren Sie 2-3 Mal, um sie zu mischen.</li>
		<li>Auf- bis zu 10 ml mit Isolationspuffer auf- und sanft pipette auf und ab 2-3 mal auf- und abladen.</li>
		<li>Legen Sie das Rohr in eine Magnetstation und inkubieren Sie bei RT für 3 min.</li>
		<li>Halten Sie den Magneten und das Rohr zusammen und in einer Bewegung den Magneten und das Rohr zusammen, um die Zellsuspension in das neue Rohr zu gießen. Entsorgen Sie die alte Röhre.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 4.2.8 (reduzieren Sie die Inkubationszeit auf 2 min) und gießen Sie die B-Zellsuspension in ein sauberes konisches Rohr.</li>
		<li>Die angereicherten B-Zellen sind einsatzbereit. Wenn Zellen sofort verwendet werden, fahren Sie mit Abschnitt 4.3 (Menschliche B-Zell-Erweiterung) fort. Überprüfen Sie die Reinheit der isolierten B-Zellen durch Durchflusszytometrie (optional). Wenn Zellen vor der Verwendung eingefroren werden sollen, fahren Sie mit Schritt 4.2.12 fort.</li>
		<li>Um die B-Zellen einzufrieren, Zentrifuge bei 400 × g für 5 min, und entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.</li>
		<li>Setzen Sie die Zellen im Gefriermedium bei 107 Zellen/ml und aliquot 1 ml/kryovial aus.</li>
		<li>Den Kryovial in den gekühlten Gefrierbehälter geben und über Nacht bei -80 °C lagern; dann übertragen Sie die gefrorene kryovial in einen flüssigen Stickstofftank; gefroreneNZellen bis zu 1 Jahr aufbewahren. HINWEIS: Die erwartete Ausbeute isolierter B-Zellen beträgt 2 % –8 % der gesamten PBMCs mit einer Lebensfähigkeit von 95 % bis 99 %.</li>
	</ol></li>
	<li>Menschliche B-Zell-Erweiterung HINWEIS: Wenn Sie frisch isolierte B-Zellen verwenden, überspringen Sie die Schritte 4.3.1–4.3.5. Zählen Sie die Zellen und übertragen Sie die erforderliche Anzahl von Zellen in ein steriles konisches Rohr und fahren Sie mit Schritt 4.3.6 fort.<ol>
<li>Vorwarmes fetales Rinderserum (FBS) in einem Wasserbad vor dem Auftauen der B-Zellen. 20 ml B-Zell-Expansionsmedium vorbereiten, vor Gebrauch mindestens 15 min in einen T25-Kolben übertragen und das Medium in einem Gewebekultur-Inkubator (bei 37 °C, 5%CO2, mit Feuchtigkeit) voraussetzen.</li>
		<li>B-Zellen in einem 37 °C-Wasserbad auftauen. Während des Wartens 2 ml vorgewärmter FBS in ein steriles 15 ml konisches Rohr übertragen.</li>
		<li>Nachdem die B-Zellen vollständig aufgetaut sind, fügen Sie sofort 1 ml vorgewärmtes FBS tropfenweise in die Probe ein. Bei RT für 1 min inkubieren.</li>
		<li>Sanfte Pipette, um die Probe wieder auszusetzen und das gesamte Volumen tropfenweise in ein konisches Rohr mit 2 ml vorgewärmtem FBS zu übertragen.</li>
		<li>Erhöhen Sie das Volumen auf 15 ml mit sterilem 1x PBS, Kappe, und invertieren Sie das Rohr vorsichtig 2-3 mal.</li>
		<li>Zentrifuge bei 400 × g für 5 min.</li>
		<li>Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören, setzen Sie das Zellpellet mit 1 ml vorädlibriertem B-Zell-Expansionsmedium wieder auf und zählen Sie die Zellen. Die Gesamtzellenzahl sollte etwa 107 Zellen betragen.</li>
		<li>Übertragen Sie die Zellen in einen Kolben, der 20 ml des vorädlibierten B-Zell-Ausdehnungsmediums enthält. Die Endkonzentration der Zellen sollte etwa 5 x 105 Zellen/ml betragen.</li>
		<li>Inkubieren Sie den Kolben vertikal in einem Gewebekultur-Inkubator.</li>
		<li>Erfrischen Sie das Expansionsmedium alle 2 Tage vollständig, indem Sie das gesamte Volumen der B-Zellen in ein steriles Konusrohr übertragen und die Schritte 4.3.6–4.3.9 wiederholen. HINWEIS: T25-Kolben kann 10–20 ml Medium aufnehmen; Der T75-Kolben kann bis zu 20–60 ml Medium aufnehmen.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Primäres menschliches B-Zell-Engineering
<ol><li>Engineer B-Zellen bei 48 ± 2 h nach Erweiterung/Aktivierung für optimale Ergebnisse. Bereiten Sie das B-Zell-Expansionsmedium, aliquot 1 ml des Mediums in eine 48-Well-Gewebekulturplatte vor und vor dem Einsetzen in einem Gewebekultur-Inkubator vor. HINWEIS: Führen Sie beim Entwerfen einer CRISPR/Cas9 sgRNA für ein Gen von Interesse die unten beschriebenen Schritte aus. - Entwerfen Sie sgRNAs mit einem Online-Tool11. - Design sgRNAs auf einem Exon, das allen Isoformen des Proteins gemeinsam ist. - Bestellen Sie chemisch modifizierte sgRNA von seriösen Unternehmen. - sgRNA kommt in der Regel in lyophilisierter Form; rekonstituieren sgRNA im sterilen DNase/RNase-freien Tris-EDTA (TE)-Puffer bis zu einer Konzentration von 1 g/l.</li>
	<li>Vorbereiten Sie das TRANSfizierungssubstrat CRISPR/Cas9, indem Sie 1 l (1 g/l) chemisch modifizierte sgRNA mit 1,5 l (1 g/l) chemisch modifizierten Streptococcus pyogenes Cas 9 (S.p. Cas9) Nuklease pro Transfektionsreaktion mischen. Verwenden Sie zur Steuerung 1 L TE-Puffer anstelle von sgRNA. HINWEIS: Wenn CD19 sgRNA für ein Gen-KO-Experiment verwendet wird, siehe Abbildung 2 für Ergebnisse. Wenn AAVS1 sgRNA für ein Gen-KI-Experiment verwendet wird, siehe Abbildung 5 für Ergebnisse.<ul>
<li>Halten Sie alle Komponenten auf Eis.</li>
	</ul></li>
	<li>Sanft mischen und 2,5 l CRISPR/Cas9 Transfecting Substrat pro Reaktion in ein Rohr eines 0,2 ml 8-Rohr-Streifens übertragen; bei RT beiseite gelegt werden.</li>
	<li>Schalten Sie einen Nukleofektor (Elektroporator) ein und bereiten Sie Transfektionsreagenzien wie in Tabelle 1dargestellt vor. HINWEIS: Dies ist ein guter Schritt für eine Pause, falls erforderlich, indem alle Reagenzien auf Eis gelegt werden. Entfernen Sie alle Reagenzien vom Eis, wenn Sie bereit sind, das Experiment fortzusetzen. Bei der Verwendung von S.p. Cas9-Protein MUSS der Prüfer den vorkomplexen CRISPR/Cas9-sgRNA-Ribonucleoprotein durch Mischen von 1 g sgRNA mit 5 g S.p. Cas9-Protein, Vermeidung von Blasen und Inkubation der Mischung bei RT für mindestens 20 min vor dem Einsatz für optimale Ergebnisse.</li>
	<li>Zählen und übertragen Sie 106 B Zellen pro Transfektionsreaktion in ein steriles konisches Rohr.</li>
	<li>Erhöhen Sie das Volumen auf 15 ml mit sterilem 1x PBS und Zentrifuge bei 400 × g für 5 min. Während des Wartens das primäre Zelltransfektionsreagenz (Tabelle 2) vorbereiten und bei RT beiseite stellen.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören.</li>
	<li>Das Zellpellet mit 10 ml sterilem 1x PBS und Zentrifuge bei 400 × g für 5 min wieder aufsetzen.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand vollständig, ohne das Zellpellet zu stören.</li>
	<li>Übertragen Sie 0,5 g chemisch modifizierte GFP mRNA (als Transfektionsreporter) pro 106 B Zellen auf das Zellpellet (optional).</li>
	<li>Das Zellpellet mit einem Primärzelltransfektionsreagenz von 20 L pro 106 B-Zellen wieder aufsetzen; 5-6-mal sanft mischen. Übertragen Sie 20,5 l l pro Transfektionsreaktion in das 0,2 ml-Rohr des 8-Rohr-Streifens, der 2,5 l des CRISPR/Cas9-Transfektionssubstrats enthält.</li>
	<li>Einmal nach oben und unten pfeifen, um das gesamte Volumen (23 l) zu mischen und in eine Transfektionsküvette zu übertragen. Kappen und tippen Sie vorsichtig auf die Küvette auf der Bank, um sicherzustellen, dass die Flüssigkeit den Boden der Küvette bedeckt.</li>
	<li>Verwenden Sie menschliches primäres B-Zell-Protokoll auf dem Nukleofektor für die Transfektion. HINWEIS: Der Nukleofektor (Elektroporator) kann platziert und außerhalb der Gewebekulturhaube verwendet werden. Kappen Sie die Küvette, um Sterilität zu gewährleisten.</li>
	<li>Die elektropolierten Zellen in der Küvette bei RT 15 min ruhen.</li>
	<li>Übertragen Sie 80 l des vorädierten B-Zell-Expansionsmediums von der Gewebekulturplatte in die Transfektionsreaktion in der Küvette. Die Küvette 30 min im Inkubator der Gewebekultur unterbringen.</li>
	<li>Ein paar Mal sanft Pipette mischen und das gesamte Volumen der Probe von der Küvette in einen geeigneten Brunnen einer 48-Well-Gewebekulturplatte mit 1 ml des B-Zell-Expansionsmediums übertragen. Die Endkonzentration der Zellen sollte 106 Zellen/ml betragen.</li>
	<li>Wenn Sie ein Gen-KI-Experiment durchführen, übertragen Sie den rAAV6-Vektor bei 500.000 Infektionsvielfalt in den entsprechenden Brunnen, der elektroporated Zellen enthält (ca. 45 min nach der Elektroporation). Siehe Beispiel rAAV6 Vektorkonstrukt in Abbildung 4A. HINWEIS: Zum Beispiel: Ein Steuermuster wird ohne CRISPR/Cas9 oder den rAAV6-Vektor elektropoiert. Eine reine Vektorprobe wird ohne CRISPR/Cas9 elektropoiert und dann mit dem rAAV6-Vektor transduziert. Eine KI-Probe wird mit CRISPR/Cas9 elektropoiert und dann mit dem rAAV6-Vektor transduziert. rAAV6 muss Homologiearme nach oben und unterhalb des Ziel-DSB-Standorts für HDR enthalten.</li>
	<li>Legen Sie die Platte in einen Gewebekultur-Inkubator bei 37 °C und 5%CO2 mit Feuchtigkeit.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellen und zeichnen Sie die Lebensfähigkeit am tag 1 nach dem Engineering auf.</li>
	<li>Erfrischen Sie das B-Zell-Expansionsmedium alle 2 Tage, indem Sie die Zellen zählen und dann das gesamte Volumen der Zellen in ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr übertragen. Zentrifugieren Sie bei 400 × g für 5 min, und entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Setzen Sie die Zellen mit 100 l frischem B-Zell-Expansionsmedium aus und übertragen Sie sie auf einen Brunnen einer 24-Well-Gewebekulturplatte. Bringen Sie das mittlere Volumen auf, um eine endgültige Zellkonzentration bei 5 × 105 Zellen/ml zu erreichen. HINWEIS: Eine 48-Well-Platte kann bis zu 1 ml Medium/Well aufnehmen; eine 24-Well-Platte kann bis zu 2 ml Mittel/Gut aufnehmen; eine 12-Well-Platte kann bis zu 4 ml Mittel/Well aufnehmen, und eine 6-Well-Platte kann bis zu 8 ml Medium/Well aufnehmen.</li>
	<li>Erlauben Sie den entwickelten Zellen, sich für mindestens 5 Tage zu erweitern, bevor Sie nachgelagerte Analysen durchführen, z. B. für die Analyse der Durchflusszytometrie, die TIDE-Analyse und die Anschluss-PCR.</li>
</ol>

<ol>
	<li>LeBien, T. W., Thomas, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes:+how+they+develop+and+function.">B lymphocytes: how they develop and function.</a> Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).</li><li>Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+antibody-secreting+plasma+cells.">The generation of antibody-secreting plasma cells.</a> Nature Reviews Immunology. 15, 160-171 (2015).</li><li>Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. K., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humoral+immunity+due+to+long-lived+plasma+cells.">Humoral immunity due to long-lived plasma cells.</a> Immunity. 8 (3), 363-372 (1998).</li><li>Spriggs, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+human+CD40+ligand+stimulates+B+cell+proliferation+and+immunoglobulin+E+secretion.">Recombinant human CD40 ligand stimulates B cell proliferation and immunoglobulin E secretion.</a> Journal of Experimental Medicines. 176 (6), 1543-1550 (1992).</li><li>Fusil, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lentiviral+vector+allowing+physiologically+regulated+membrane-anchored+and+secreted+antibody+expression+depending+on+B-cell+maturation+status.">A lentiviral vector allowing physiologically regulated membrane-anchored and secreted antibody expression depending on B-cell maturation status.</a> Molecular Therapy. 23 (11), 1734-1747 (2015).</li><li>Luo, X. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+human+hematopoietic+stem/progenitor+cells+to+produce+a+broadly+neutralizing+anti-HIV+antibody+after+in+vitro+maturation+to+human+B+lymphocytes.">Engineering human hematopoietic stem/progenitor cells to produce a broadly neutralizing anti-HIV antibody after in vitro maturation to human B lymphocytes.</a> Blood. 113 (7), 1422-1431 (2008).</li><li>Mock, U., Thiele, R., Uhde, A., Fehse, B., Horn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+lentiviral+transduction+and+transgene+expression+in+primary+human+B+cells.">Efficient lentiviral transduction and transgene expression in primary human B cells.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (6), 408-415 (2012).</li><li>Heltemes-Harris, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+Beauty+transposon+screen+identifies+signaling+modules+that+cooperate+with+STAT5+activation+to+induce+B-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">Sleeping Beauty transposon screen identifies signaling modules that cooperate with STAT5 activation to induce B-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Oncogene. 35 (26), 3454-3464 (2016).</li><li>Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+primary+human+B+cells+with+CRISPR/Cas9+targeted+nuclease.">Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease.</a> Scientific Reports. 8, 12144 (2018).</li><li>Hung, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+protein-secreting+plasma+cells+by+homology-directed+repair+in+primary+human+B+cells.">Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells.</a> Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).</li><li>Cui, Y., Xu, J., Cheng, M., Liao, X., Peng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+CRISPR/Cas9+sgRNA+design+tools.">Review of CRISPR/Cas9 sgRNA design tools.</a> Interdisciplinary Sciences. 10 (2), 455-465 (2018).</li><li>Rees, H. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Base+editing:+precision+chemistry+on+the+genome+and+transcriptome+of+living+cells.">Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (12), 770-788 (2018).</li><li>Spiegel, A., Bachmann, M., Jurado Jim&#233;nez, G., Sarov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-based+knockout+pipeline+for+reverse+genetics+in+mammalian+cell+culture.">CRISPR/Cas9-based knockout pipeline for reverse genetics in mammalian cell culture.</a> Methods. 164-165, 49-58 (2019).</li><li>Suzuki, T., Kazuki, Y., Oshimura, M., Hara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+system+for+simultaneous+or+sequential+integration+of+multiple+gene-loading+vectors+into+a+defined+site+of+a+human+artificial+chromosome.">A novel system for simultaneous or sequential integration of multiple gene-loading vectors into a defined site of a human artificial chromosome.</a> PLoS One. 9, 110404 (2014).</li><li>Bak, R. O., Porteus, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+integration+of+large+gene+cassettes+using+AAV+donor+vectors.">CRISPR-mediated integration of large gene cassettes using AAV donor vectors.</a> Cell Reports. 20 (3), 750-756 (2017).</li><li>Shirley, J. L., de Jong, Y. P., Terhorst, C., Herzog, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+viral+gene+therapy+vectors.">Immune responses to viral gene therapy vectors.</a> Molecular Therapy. 28 (3), 709-722 (2020).</li><li>Martino, A. T., Markusic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+mechanisms+against+AAV+vectors+in+animal+models.">Immune response mechanisms against AAV vectors in animal models.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 17, 198-208 (2020).</li></ol>

Es wurde ein Patent über die Methoden der Herstellung und Verwendung genombearbeiteter B-Zellen mit M.J.J,K.L. und B.S.M als Erfinder eingereicht. B.S.M ist Berater für immusoft Inc. Immusoft Inc. Immusoft Inc. hat Forschung im Labor von B.S.M gesponsert.

Präzise Genom-Engineering in primären menschlichen B-Zellen war bis vor kurzem eine Herausforderung9,10. Wir hatten zuvor Protokolle veröffentlicht, die CRISPR/Cas9 verwenden, um primäre menschliche B-Zellen9zu entwickeln. Hier skizzieren wir verbesserte Protokolle für B-Zell-Isolation, -Erweiterung und -Engineering, um eine effiziente KO von CD19 oder einKnock-in EGFPzu ermöglichen.
Hier zeigen w...

B-Zellen sind eine Untergruppe der Lymphozytenlinie, die aus hämatopoetischen Stammzellen abgeleitet wird. Sie spielen eine entscheidende Rolle im adaptiven humoralen Immunsystem, indem sie große Mengen an Antikörpern als Reaktion auf Immunherausforderungen produzieren1. B-Zellen sind auch Vorläufer von Gedächtnis-B-Zellen und den endlos differenzierten, langlebigen Plasmazellen und bieten so eine dauerhafte humorale Immunität2. Insbesondere Plasmazellen sind einzigartig unter Immunzellen in ihrer Fähigkeit, große Mengen eines bestimmten Antikörpers zu produzieren, während sie über Jahre oder Jahrzehnte überleben3. Darüber hinaus macht die einfache Isolierung von peripherem Blut die B-Zell-Linie zu einem ausgezeichneten Kandidaten für neuartige zellbasierte Therapien4.
Bisher wurden zufällige Integrationsmethoden, wie z. B. mit lentiviralen Vektoren oder einem Sleeping Beauty-Transposon, verwendet, um B-Zellen für die Transgenabgabe und Expression5,6,7,8zu entwickeln. Die Unspezifische Natur dieser Ansätze erschwert jedoch die Untersuchung der biologischen Funktionen eines bestimmten Gens in den B-Zellen und birgt ein inhärentes Risiko einer Insertionsmutagenese und einer variablen Transgenexpression und/oder Silencing in der therapeutischen Umgebung.
Das CRISPR/Cas9-System ist ein leistungsfähiges Genom-Engineering-Tool, mit dem Forscher das Genom verschiedener Zellen in zahlreichen Arten präzise bearbeiten können. Kürzlich haben zwei Gruppen, darunter unsere eigene, erfolgreich Methoden zur Ex-vivo-Expansion und gezielte Genom-Engineering von primären menschlichen B-Zellen9,10entwickelt. Wir werden den Prozess der Reinigung primärer menschlicher B-Zellen aus einer Leukaphoreseprobe beschreiben. Danach beschreiben wir unser aktualisiertes Protokoll zur B-Zell-Erweiterung und Aktivierung isolierter B-Zellen. Wir beschreiben dann ein Verfahren zum Ausklopfen des Differenzierungsclusters 19 (CD19), eines spezifischen B-Zell-Rezeptors und eines Kennzeichens von B-Zellen, durch Elektroporation, um CRISPR/Cas9 mRNA zusammen mit CD19 sgRNA in aktivierte B-Zellen einzuführen.
Cas9 mRNA wird übersetzt und bindet an die CD19 sgRNA zu einem CRISPR/Cas9-sgRNA Ribonukleoprotein-Komplex (RNP). Anschließend führt sgRNA im Komplex Cas9 zu Doppelstrangbruch (DSB) an der Zielsequenz auf Exon 2 des Gens. Die Zellen reparieren das DSB durch "nicht-homologe Endverbindung" durch Die Einführung oder Löschung von Nukleotiden, was zu Frameshift-Mutationen führt und dazu führt, dass das Gen ausgeschlagen wird. Wir messen dann den Verlust von CD19 durch Strömungszytometrie und analysieren die Indelbildung, indem wir Indels durch Zersetzungsanalyse (TIDE) verfolgen.
Wir beschreiben dann den Prozess der Verwendung von CRISPR/Cas9 zusammen mit einem rekombinanten AAV6-Vektor (rAAV6, eine Spendervorlage für homologiegesteuerte Reparatur (HDR)), um die standortspezifische Einfügung von verbessertem grünem Fluoreszenzprotein(EGFP) an der adeno-assoziierten Virusintegrationsstelle 1 (AAVS1) zu vermitteln. Das AAVS1-Gen ist ein aktiver Ort ohne bekannte biologische Funktionen und eine AAV-Virusintegrationsstelle im menschlichen Genom; Daher gilt es als "sicherer Hafen" für die Genomtechnik. Hier berichten wir, dass die Erweiterung und Aktivierung von B-Zellen eine bis zu 44-fache Expansion in 7 Tagen Kultur ermöglichte (Abbildung 1). Die Elektroporation von B-Zellen zeigte eine leichte Reduktion der allgemeinen Zellgesundheit (Abbildung 2A) bei 24 h nach der Transfektion. Die Streudiagrammanalyse des CD19-Markers (Abbildung 2B) zeigte eine Reduktion der bearbeiteten Zellen um bis zu 83 % (Abbildung 2C).
Die TIDE-Analyse der Chromatographen (Abbildung 3A) ergab, dass die % indels dem % Proteinverlust durch Durchflusszytometrie ähnelten (Abbildung 3B). Die Durchflusszytometrie-Analyse des KI-Experiments zeigte, dass die Zellen, die den AAV-Vektor erhielten (Abbildung 4), zusammen mit RNP bis zu 64% EGFP-positive Zellen exprimierten (Abbildung 5A) und später eine erfolgreiche Integration durch Junction-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zeigten (Abbildung 5B). Die Anzahl der Zellen zeigte, dass sich alle Proben innerhalb von 3 Tagen nach dem Engineering schnell erholten (Abbildung 5C).

<table><tbody><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug</td><td>IDT</td><td>1081059</td><td>smaller size is also available</td></tr><tr><td>Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT)</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer</td><td>Quality Biological</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>CleanCap chemically modified Cas9 mRNA</td><td>Trilink Biotechnology</td><td>L-7206-1000</td><td></td></tr><tr><td>CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg</td><td>Invivogen</td><td>TLRL-2006-5</td><td>different sizes available</td></tr><tr><td>Cryostor CS10, 100 mL</td><td>STEMCELL Technology</td><td>7930</td><td></td></tr><tr><td>CTS Immune Cell SR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A2596101</td><td></td></tr><tr><td>EasySep human B cells isolation kit</td><td>STEMCELL Technology</td><td>17954</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience fixable viability dye eFlour 780</td><td>eBiosciences</td><td>65-0865-14</td><td></td></tr><tr><td>Excellerate B cell media, Xeno-free</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>CCM031</td><td>B-cell basal medium</td></tr><tr><td>Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube</td><td>Corning</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>S11550</td><td>For thawing B cells only</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>GeneMate SnapStrip&amp;reg; 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps</td><td>BioExpress</td><td>T-3035-1 / 490003-692</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS</td><td>GE lifesciences</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Lonza 4D Nucleofector core unit</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002B</td><td></td></tr><tr><td>Lonza 4D Nucleofector X unit</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002X</td><td></td></tr><tr><td>Mega CD40 Ligand</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-522-110-C010</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1562-1EA</td><td>For freezing cells</td></tr><tr><td>Pen/Strep 100X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TMS-AB2-C</td><td></td></tr><tr><td>PerCP anti-human CD19 clone HIB19</td><td>biolegend</td><td>302228</td><td>smaller size is also available</td></tr><tr><td>rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.)</td><td>Vigene Biosciences</td><td>N/A</td><td>large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL</td></tr><tr><td>Recombinant human IL-10 protein 250 ug</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>217-IL-250</td><td>different sizes available</td></tr><tr><td>Recombinant human IL-15 protein 25 ug</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>247-ILB-025</td><td>different sizes available</td></tr><tr><td>The Big Easy EasySep Magnet</td><td>STEMCELL Technology</td><td>18001</td><td>different sizes available</td></tr><tr><td>Tris-EDTA (TE) buffer</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2476100</td><td></td></tr></tbody></table>

genome engineering of primary human b cells using crispr/cas9

B-Zellen sind Lymphozyten, die aus hämatopoetischen Stammzellen gewonnen werden und ein wichtiger Bestandteil des humoralen Arms des adaptiven Immunsystems sind. Sie machen attraktive Kandidaten für zellbasierte Therapien wegen ihrer einfachen Isolation von peripherem Blut, ihrer Fähigkeit, sich in vitro auszudehnen, und ihrer Langlebigkeit in vivo. Darüber hinaus kann ihre normale biologische Funktion – zur Produktion großer Mengen von Antikörpern – genutzt werden, um sehr große Mengen eines therapeutischen Proteins auszudrücken, wie z. B. einen rekombinanten Antikörper zur Bekämpfung von Infektionen oder ein Enzym zur Behandlung von Enzymopathien. Hier bieten wir detaillierte Methoden zur Isolierung primärer menschlicher B-Zellen aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) und zur Aktivierung/Erweiterung isolierter B-Zellen in vitro. Anschließend zeigen wir die Schritte zur Verwendung des CRISPR/Cas9-Systems für standortspezifische KO endogene Gene in B-Zellen. Diese Methode ermöglicht effizienteko verschiedener Gene, die verwendet werden können, um die biologischen Funktionen von Genen von Interesse zu studieren. Anschließend zeigen wir die Schritte zur Verwendung des CRISPR/Cas9-Systems zusammen mit einem rekombinanten, adeno-assoziierten, viralen (rAAV) Vektor für eine effiziente standortspezifische Integration einer transgenen Expressionskassette in B-Zellen. Zusammen bietet dieses Protokoll eine Schritt-für-Schritt-Engineering-Plattform, die in primären menschlichen B-Zellen verwendet werden kann, um biologische Funktionen von Genen sowie für die Entwicklung von B-Zell-Therapeutika zu untersuchen.

Das aktualisierte Erweiterungs- und Aktivierungsprotokoll ermöglichte eine schnelle Expansion von B-Zellen bis zum 44-fachen in 7 Tagen(Abbildung 1; n =3 Spender). Im KO-Experiment zeigte die B-Zellzahl mit Trypan-Blaufärbung mehr als 80% lebensfähige Zellen mit einer leichten Reduktion der Zellrückgewinnung sowohl bei der Kontrolle als auch bei den CD19 KO-Proben bei 24 h Nachelektroporation(Abbildung 2A;p ≥ 0,05, n = 3 Spender). Dieses Ergebnis zeigt, da...

Watch this Scientific Journal Video about Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9 at JoVE.com

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

Hier stellen wir ein detailliertes, schrittweises Protokoll für die CRISPR/Cas9-basierte Genom-Engineering von primären menschlichen B-Zellen für Gen Knockout (KO) und Knock-in (KI) zur Untersuchung der biologischen Funktionen von Genen in B-Zellen und der Entwicklung von B-Zell-Therapeutika zur Verfügung.

Genom-Engineering von primären menschlichen B-Zellen mit CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

genome-engineering-of-primary-human-b-cells-using-crisprcas9

Research

JoVE Journal

Biology

6.1K Aufrufe.  University of Minnesota. Hier stellen wir ein detailliertes, schrittweises Protokoll für die CRISPR/Cas9-basierte Genom-Engineering von primären menschlichen B-Zellen für Gen Knockout (KO) und Knock-in (KI) zur Untersuchung der biologischen Funktionen von Genen in B-Zellen und der Entwicklung von B-Zell-Therapeutika zur Verfügung.

Serie: Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to generate RNA-guided nucleases, such as CRISPR-associated (Cas) 9 for site-specific eukaryotic genome editing. Genome engineering by Cas9 is used to efficiently, easily and robustly modify endogenous genes in many biomedically-relevant mammalian cell lines and organisms. Here we show an example of how to utilize the CRISPR/Cas9 methodology to understand the biological function of specific genetic mutations. We model calreticulin (CALR) mutations in murine interleukin-3 (mIL-3) dependent pro-B (Ba/F3) cells by delivery of single guide RNAs (sgRNAs) targeting the endogenous Calr locus in the specific region where insertion and/or deletion (indel) CALR mutations occur in patients with myeloproliferative neoplasms (MPN), a type of blood cancer. The sgRNAs create double strand breaks (DSBs) in the targeted region that are repaired by non-homologous end joining (NHEJ) to give indels of various sizes. We then employ the standard Ba/F3 cellular transformation assay to understand the effect of physiological level expression of Calr mutations on hematopoietic cellular transformation. This approach can be applied to other genes to study their biological function in various mammalian cell lines.

Targeted gene editing using CRISPR/Cas9 has greatly facilitated the understanding of the biological functions of genes. Here, we utilize the CRISPR/Cas9 methodology to model calreticulin mutations in cytokine-dependent hematopoietic cells in order to study their oncogenic activity.

Mit CRISPR/Cas9 gen untersuchen die Onkogene Aktivität des mutierten Calreticulin in Cytokine abhängigen hämatopoetischen Zellen bearbeiten

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

Forschung

Krebsforschung

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. Complete gene ablation in HSCs required the generation of knockout mice from which HSCs could be isolated, and gene ablation in primary human HSCs was not possible. Viral transduction could be used for knock-down approaches, but these suffered from variable efficacy. In general, genetic manipulation of human and mouse hematopoietic cells was hampered by low efficiencies and extensive time and cost commitments. Recently, CRISPR/Cas9 has dramatically expanded the ability to engineer the DNA of mammalian cells. However, the application of CRISPR/Cas9 to hematopoietic cells has been challenging, mainly due to their low transfection efficiencies, the toxicity of plasmid-based approaches and the slow turnaround time of virus-based protocols.
A rapid method to perform CRISPR/Cas9-mediated gene editing in murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with knockout efficiencies of up to 90% is provided in this article. This approach utilizes a ribonucleoprotein (RNP) delivery strategy with a streamlined three-day workflow. The use of Cas9-sgRNA RNP allows for a hit-and-run approach, introducing no exogenous DNA sequences in the genome of edited cells and reducing off-target effects. The RNP-based method is fast and straightforward: it does not require cloning of sgRNAs, virus preparation or specific sgRNA chemical modification. With this protocol, scientists should be able to successfully generate knockouts of a gene of interest in primary hematopoietic cells within a week, including downtimes for oligonucleotide synthesis. This approach will allow a much broader group of users to adapt this protocol for their needs.

A protocol for fast CRISPR/Cas9-mediated gene disruption in mouse and human primary hematopoietic cells is described in this article. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins are introduced via electroporation with sgRNAs generated through in vitro transcription and commercial Cas9. High editing efficiencies are achieved with limited time and financial cost.

Hocheffiziente gen Störung der murinen und menschlichen hämatopoetischen Vorläuferzellen von CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Genetik

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been successfully repurposed for genome engineering in many different living organisms. Most commonly, the wildtype CRISPR associated 9 (Cas9) or Cas12a endonuclease is used to cleave specific sites in the genome, after which the DNA double-stranded break is repaired via the non-homologous end joining (NHEJ) pathway or the homology-directed repair (HDR) pathway depending on whether a donor template is absent or present respectively. To date, CRISPR systems from different bacterial species have been shown to be capable of performing genome editing in mammalian cells. However, despite the apparent simplicity of the technology, multiple design parameters need to be considered, which often leave users perplexed about how best to carry out their genome editing experiments. Here, we describe a complete workflow from experimental design to identification of cell clones that carry desired DNA modifications, with the goal of facilitating successful execution of genome editing experiments in mammalian cell lines. We highlight key considerations for users to take note of, including the choice of CRISPR system, the spacer length, and the design of a single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor template. We envision that this workflow will be useful for gene knockout studies, disease modeling efforts, or the generation of reporter cell lines.

CRISPR-Cas is a powerful technology to engineer the complex genomes of plants and animals. Here, we detail a protocol to efficiently edit the human genome using different Cas endonucleases. We highlight important considerations and design parameters to optimize editing efficiency.

Genom-Bearbeitung in Säugetieren Zelllinien mit CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

Generierung definierter genomischer Modifikationen mit CRISPR-CAS9 in humanen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Ein Leitfaden für den präzisen Genaufschluss in primären Makrophagen aus dem Knochenmark

High-Efficiency Gene Disruption in Primary Bone Marrow-Derived Macrophages Using Electroporated Cas9-sgRNA Complexes

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) from mice are a key tool for studying the complex biology of tissue macrophages. As primary cells, they model the physiology of macrophages in vivo more closely than immortalized macrophage cell lines and can be derived from mice already carrying defined genetic changes. However, disrupting gene function in BMDMs remains technically challenging. Here, we provide a protocol for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in BMDMs, which allows for the introduction of small insertions and deletions (indels) that result in frameshift mutations that disrupt gene function. The protocol describes how to synthesize single-guide RNAs (sgRNA-Cas9) and form purified sgRNA-Cas9 ribonucleoprotein complexes (RNPs) that can be delivered by electroporation. It also provides an efficient method for monitoring editing efficiency using routine Sanger sequencing and a freely available online analysis program. The protocol can be performed within 1 week and does not require plasmid construction; it typically results in 85% to 95% editing efficiency.

Autor im Rampenlicht: Effiziente CRISPR/Cas9-Genomeditierung in Makrophagen aus dem Knochenmark für präzisen Genaufschluss

This protocol describes the procedure for genome editing in mouse bone marrow-derived macrophages using Cas9-sgRNA ribonucleoprotein complexes assembled in vitro and delivered by electroporation.

Hocheffiziente Genzerstörung in primären Makrophagen aus dem Knochenmark unter Verwendung elektroporierter Cas9-sgRNA-Komplexe

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) from mice are a key tool for studying the complex biology of tissue macrophages. As primary cells, they model the ...

Engineering Oncogenic Heterozygous Gain-of-Function Mutations in Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Throughout their lifetime, hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) acquire somatic mutations. Some of these mutations alter HSPC functional properties such as proliferation and differentiation, thereby promoting the development of hematologic malignancies. Efficient and precise genetic manipulation of HSPCs is required to model, characterize, and better understand the functional consequences of recurrent somatic mutations. Mutations can have a deleterious effect on a gene and result in loss-of-function (LOF) or, in stark contrast, may enhance function or even lead to novel characteristics of a particular gene, termed gain-of-function (GOF). In contrast to LOF mutations, GOF mutations almost exclusively occur in a heterozygous fashion. Current genome-editing protocols do not allow for the selective targeting of individual alleles, hampering the ability to model heterozygous GOF mutations. Here, we provide a detailed protocol on how to engineer heterozygous GOF hotspot mutations in human HSPCs by combining CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair and recombinant AAV6 technology for efficient DNA donor template transfer. Importantly, this strategy makes use of a dual fluorescent reporter system to allow for the tracking and purification of successfully heterozygously edited HSPCs. This strategy can be employed to precisely investigate how GOF mutations affect HSPC function and their progression toward hematological malignancies.

Novel strategies to faithfully model somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) are necessary to better study hematopoietic stem cell biology and hematological malignancies. Here, a protocol to model heterozygous gain-of-function mutations in HSPCs by combining the use of CRISPR/Cas9 and dual rAAV donor transduction is described.

Entwicklung onkogener heterozygoter Gain-of-Function-Mutationen in humanen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen

Throughout their lifetime, hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) acquire somatic mutations. Some of these mutations alter HSPC functional ...

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging in primary NK cells. For example, transgene delivery using lentiviral or retroviral transduction resulted in a limited yield of genetically-engineered NK cells due to substantial procedure-associated NK cell apoptosis. We describe here a DNA-free method for genome editing of human primary and expanded NK cells using Cas9 ribonucleoprotein complexes (Cas9/RNPs). This method allowed efficient knockout of the TGFBR2 and HPRT1 genes in NK cells. RT-PCR data showed a significant decrease in gene expression level, and a cytotoxicity assay of a representative cell product suggested that the RNP-modified NK cells became less sensitive to TGF&#946;. Genetically modified cells could be expanded post-electroporation by stimulation with irradiated mbIL21-expressing feeder cells.

Here, we present a protocol to genetically modify primary or expanded human natural killer (NK) cells using Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). By using this protocol, we generated human NK cells deficient for transforming growth factor&#8211;b receptor 2 (TGFBR2) and hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).

Generation von Knock-out-Grund- und erweiterten menschlichen NK-Zellen mit Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

Immunologie und Infektion

Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with hematological malignancies and are currently being investigated for various solid tumors. CAR-T cells are generated by removing T cells from a patient's blood and engineering them to express a synthetic immune receptor that redirects the T-cells to recognize and eliminate target tumor cells. Gene editing of CAR-T cells has the potential to improve safety of current CAR-T cell therapies and further increase the efficacy of CAR-T cells. Here, we describe methods for the activation, expansion, and characterization of human CRISPR-engineered CD19 directed CAR-T cells. This comprises transduction of the CAR lentiviral vector and use of single guide RNA (sgRNA) and Cas9 endonuclease to target genes of interest in T cells. The methods described in this protocol can be universally applied to other CAR constructs and target genes beyond the ones used for this study. Furthermore, this protocol discusses strategies for gRNA design, lead gRNA selection and target gene knockout validation to reproducibly achieve high-efficiency, multiplex CRISPR-Cas9 engineering of clinical grade human T cells.

Here, we present a protocol for gene editing in primary human T cells using CRISPR Cas Technology to modify CAR-T cells.

Genom-Engineering von primären menschlichen B-Zellen mit CRISPR/Cas9

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video

Mit CRISPR/Cas9 gen untersuchen die Onkogene Aktivität des mutierten Calreticulin in Cytokine abhängigen hämatopoetischen Zellen bearbeiten

Hocheffiziente gen Störung der murinen und menschlichen hämatopoetischen Vorläuferzellen von CRISPR/Cas9

Genom-Bearbeitung in Säugetieren Zelllinien mit CRISPR-Cas

Generierung definierter genomischer Modifikationen mit CRISPR-CAS9 in humanen pluripotenten Stammzellen

Hocheffiziente Genzerstörung in primären Makrophagen aus dem Knochenmark unter Verwendung elektroporierter Cas9-sgRNA-Komplexe

Hocheffiziente Genzerstörung in primären Makrophagen aus dem Knochenmark unter Verwendung elektroporierter Cas9-sgRNA-Komplexe

Hocheffiziente Genzerstörung in primären Makrophagen aus dem Knochenmark unter Verwendung elektroporierter Cas9-sgRNA-Komplexe

Entwicklung onkogener heterozygoter Gain-of-Function-Mutationen in humanen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen

Generation von Knock-out-Grund- und erweiterten menschlichen NK-Zellen mit Cas9 Ribonucleoproteins

Herstellung von humanen CRISPR-engineered CAR-T Zellen