Este trabalho foi financiado pelo Fundo de Pesquisa do Câncer Infantil (CCRF) e pelo NIH R01 AI146009 para a B.S.M.

Amostras de leucemia de doadores saudáveis foram obtidas de um banco de sangue local. Todos os experimentos descritos aqui foram determinados a serem isentos para pesquisa pelo Institutional Review Board (IRB) e foram aprovados pelo Comitê de Biossegurança Institucional (IBC) da Universidade de Minnesota.
NOTA: Todos os experimentos foram realizados em conformidade com a precaução universal para patógenos transmitidos pelo sangue, com técnicas estéreis/assépticas e equipamentos de biossegurança adequados nível 2.
1. Prepare os suplementos para o meio de expansão de células B
<ol><li>Reconstituir oligonucleotídeo cpg a uma concentração de 1 mg/mL.</li>
	<li>Reconstituir o ligante CD40 (CD40L) a uma concentração de 100 μg/mL.</li>
	<li>Reconstituir il-10 humanos recombinantes (rhIL-10) a uma concentração de 50 μg/mL.</li>
	<li>Reconstituir il-15 humanos recombinantes (rhIL-15) a uma concentração de 10 μg/mL. NOTA: Mantenha cada suplemento em alíquotas pequenas a -20 °C a -80 °C por até 6 meses.</li>
</ol>2. Prepare o meio basal
<ol><li>Combine meio basal de células B com suplemento de mídia de 5% (v/v) para expansão in vitro de células imunes (por exemplo, TCS Immune Cell SR) e penicilina de 1% (v/v) e estreptomicina.</li>
	<li>Esterilize o meio basal usando um adaptador de filtro de 0,22 μm em uma garrafa esterilizada.</li>
	<li>Mantenha o meio basal a 4 °C por até 1 mês.</li>
</ol>3. Prepare o meio de expansão de células B
<ol><li>Transfira a quantidade necessária do meio basal em um recipiente estéril para cultivar as células B em 5 × 105 células/mL.</li>
	<li>Suplemente o meio basal com 1 μg/mL CpG, 100 ng/mL CD40L, 50 ng/mL rhIL-10 e 10 ng/mL rhIL-15.</li>
	<li>Filtre o meio de expansão da célula B usando um filtro de 0,22 μm.</li>
	<li>Equilibre o meio de expansão de células B na incubadora de cultura tecidual a 37 °C, 5% de CO2 com umidade por pelo menos 30 minutos antes do uso. NOTA: Prepare o meio de expansão de células B fresco para usar por um dia. Não prepare o meio de expansão de células B para usar por vários dias. Esta receita de mídia incentiva a proliferação de células B de memória e células B humanas ativadas.</li>
</ol>4. Purificação e expansão de células B humanas
NOTA: Adicione 99-100% de álcool isopropílico a um recipiente de congelamento controlado pela temperatura, seguindo as instruções do fabricante, e esfrie o recipiente de congelamento a 4 °C antes de iniciar o passo 4.1.
<ol><li>Isole pbmcs de uma amostra de leucemia
	<ol>
<li>Transfira uma amostra de leucemia (aproximadamente 8-10 mL) para um tubo cônico estéril de 50 mL.</li>
		<li>Eleça o volume para 35 mL com soro fisiológico estéril tamponado de fosfato (PBS).</li>
		<li>Coloque cuidadosamente uma amostra de leucemia de 35 mL em 15 mL de média gradiente de densidade.</li>
		<li>Centrifugar a 500 × g por 25 minutos sem freio, remover a camada de plasma sem perturbar a camada de buffy (camada PBMC), coletar os PBMCs da interface e transferir para um novo tubo cônico estéril de 50 mL.</li>
		<li>Leve os PBMCs a 50 mL com 1x PBS.</li>
		<li>Centrífuga a 500 × g por 5 min sem freio. Remova o supernatante sem perturbar a pelota PBMC, que pode parecer vermelha.</li>
		<li>Adicione 7 mL de tampão de lise de amônio-cloreto-potássio, pipeta 3 vezes para misturar bem e incubar à temperatura ambiente (RT) por 3 minutos.</li>
		<li>Eleça o volume para 50 mL com 1x PBS.</li>
		<li>Centrífuga a 400 × g por 5 min com freio de baixa resistência. Remova o supernatante sem perturbar a pelota. A pelota deve parecer rosada ou branca. NOTA: Para continuar a cultivar as células B recém-isoladas, prepare o meio de expansão de células B antes de iniciar o isolamento das células B (etapa 4.2).</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento de células B de PBMCs usando kit de isolamento negativo de células B primários humanos
	<ol>
<li>Resuspend PBMCs no tampão de isolamento para uma concentração de 5 × 107 células/mL. NOTA: Se o número total de PBMCs for inferior a 5 × 107 células, reduza o volume de tampão de isolamento para manter 5 × 107 células/mL. Os volumes mínimos e máximos de suspensão celular são de 0,25 mL e 8 mL, respectivamente.</li>
		<li>Transfira até 8 mL (5 × 107 células/mL) para um tubo estéril, polipropileno, fundo redondo com tampa.</li>
		<li>Adicione 50 μL/mL de Melhorador de Coquetéis aos PBMCs.</li>
		<li>Adicione 50 μL/mL de Coquetel de Isolamento aos PBMCs, tampa o tubo e inverta 2-3 vezes para misturar.</li>
		<li>Incubar na RT por 5 min; no4º minuto de incubação, microesferas magnéticas de vórtice por pelo menos 30 s.</li>
		<li>Transfira 50 μL de microesferas magnéticas por 1 mL de PBMCs, tampa o tubo e inverta 2-3 vezes para misturar.</li>
		<li>Cubra até 10 mL com tampão de isolamento e pipeta suavemente para cima e para baixo 2-3 vezes.</li>
		<li>Coloque o tubo em uma estação magnética e incubar em RT por 3 minutos.</li>
		<li>Segure o ímã e o tubo juntos, e em um movimento, inverta o ímã e o tubo juntos para despejar a suspensão celular no novo tubo. Descarte o tubo velho.</li>
		<li>Repita o passo 4.2.8 (reduza o tempo de incubação para 2 min) e despeje a suspensão da célula B em um tubo cônico limpo.</li>
		<li>As células B enriquecidas estão prontas para uso. Se as células forem usadas imediatamente, continue a seção 4.3 (expansão de células B humanas). Verifique a pureza das células B isoladas por citometria de fluxo (opcional). Se as células forem congeladas antes do uso, continue a etapa 4.2.12.</li>
		<li>Para congelar as células B, centrífuga a 400 × g por 5 min, e descartar o supernatante sem perturbar a pelota.</li>
		<li>Resuspenque as células em meio de congelamento a 107 células/mL, e aliquot 1 mL/criovial.</li>
		<li>Coloque o criovial no recipiente de congelamento refrigerado e armazene a -80 °C durante a noite; em seguida, transfira o criovial congelado para um tanque de nitrogênio líquido; manter células congeladas até 1 ano. NOTA: O rendimento esperado das células B isoladas é de 2%a 8% do total de PBMCs, com viabilidade de 95%-99%.</li>
	</ol></li>
	<li>Expansão de células B humanas NOTA: Se usar células B recém-isoladas, pule as etapas 4.3.1-4.3.5. Conte as células e transfira o número necessário de células para um tubo cônico estéril e continue com a etapa 4.3.6.<ol>
<li>Soro bovino fetal pré-quente (FBS) em um banho de água antes de descongelar as células B. Prepare 20 mL de meio de expansão de células B, transfira para um frasco T25 e pré-equilibre o meio em uma incubadora de cultura tecidual (a 37 °C, 5% CO2, com umidade) pelo menos 15 minutos antes do uso.</li>
		<li>Descongele as células B em um banho de água de 37 °C. Enquanto estiver esperando, transfira 2 mL de FBS pré-aquecidos em um tubo cônico estéril de 15 mL.</li>
		<li>Depois que as células B forem completamente descongeladas, adicione imediatamente 1 mL de FBS pré-aquecido, em termos de gota, na amostra. Incubar na RT por 1 min.</li>
		<li>Pipeta suavemente para resuspengar a amostra e transferir todo o volume, dropwise, em um tubo cônico contendo 2 mL de FBS pré-aquecidos.</li>
		<li>Elete o volume até 15 mL com 1x PBS estéril, tampa e inverta o tubo suavemente 2-3 vezes.</li>
		<li>Centrífuga a 400 × g por 5 min.</li>
		<li>Descarte o supernasce sem perturbar a pelota celular, resuspenque a pelota celular com 1 mL de meio de expansão pré-equilibrada de células B e conte as células. O número total de células deve ser de aproximadamente 107 células.</li>
		<li>Transfira as células para um frasco contendo 20 mL do meio de expansão pré-equilibrado da célula B. A concentração final das células deve ser de aproximadamente 5 x 105 células/mL.</li>
		<li>Incubar o frasco verticalmente em uma incubadora de cultura tecidual.</li>
		<li>Atualize completamente o meio de expansão a cada 2 dias, transferindo todo o volume de células B para um tubo cônico estéril e repetindo etapas 4.3.6-4.3.9. NOTA: O frasco T25 pode conter de 10 a 20 mL de médio; O frasco T75 pode conter até 20-60 mL de médio.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Engenharia primária de células B humanas
<ol><li>Células B do engenheiro a 48 ± 2 h após a expansão/ativação para obter resultados ideais. Prepare o meio de expansão de células B, alíquota de 1 mL do meio em uma placa de cultura tecidual de 48 poços e pré-equilíbrio em uma incubadora de cultura tecidual pelo menos 15 minutos antes do uso. NOTA: Ao projetar um sgRNA CRISPR/Cas9 para um gene de interesse, siga os passos descritos abaixo. - Projetar sgRNAs usando uma ferramenta online11. - Projetar sgRNAs em um exon que é comum a todos os isoforms da proteína. - Encomendar sgRNA quimicamente modificado de empresas respeitáveis. - sgRNA geralmente vem em forma liofilizada; sgRNA reconstituído no tampão Tris-EDTA (TE) livre de estéril DNase/RNase a uma concentração de 1 μg/μL.</li>
	<li>Prepare o substrato transfetante CRISPR/Cas9 misturando 1 μL (1 μg/μL) de sgRNA quimicamente modificado com 1,5 μL (1 μg/μL) de nuclease streptococcus pyogenes cas 9 (S.p. Cas9) quimicamente modificada por reação de transfecção. Para controle, use 1 μL de tampão TE em vez de sgRNA. NOTA: Quando o sgRNA CD19 for usado para um experimento ko genético, consulte a Figura 2 para obter resultados. Quando o SgRNA AAVS1 é usado para um experimento de GENE KI, consulte a Figura 5 para obter resultados.<ul>
<li>Mantenha todos os componentes no gelo.</li>
	</ul></li>
	<li>Misture suavemente e transfira 2,5 μL de substrato transfectante CRISPR/Cas9 por reação em um tubo de uma tira de 0,2 mL de 8 tubos; reservado em RT.</li>
	<li>Ligue um nucleofector (eletroporador) e prepare reagentes de transfecção, conforme mostrado na Tabela 1. NOTA: Este é um bom passo para uma pausa, se necessário, colocando todos os reagentes no gelo. Remova todos os reagentes do gelo quando estiver pronto para retomar o experimento. Ao usar a proteína S.p. Cas9, o pesquisador deve pré-complexo CRISPR/Cas9-sgRNA ribonucleoprotein misturando 1 μg sgRNA com 5 μg de proteína S.p. Cas9, evitando quaisquer bolhas, e incubando a mistura no RT por pelo menos 20 minutos antes de usar para resultados ideais.</li>
	<li>Conte e transfira 106 células B por reação de transfecção em um tubo cônico estéril.</li>
	<li>Eleça o volume até 15 mL com 1x PBS estéril e centrífuga a 400 × g por 5 min. Enquanto estiver esperando, prepare o reagente de transfecção celular primária(Tabela 2) e reserve no RT.</li>
	<li>Descarte o supernatante sem perturbar a pelota celular.</li>
	<li>Resuspenque a pelota celular com 10 mL de PBS estéril 1x e centrífuga a 400 × g por 5 min.</li>
	<li>Descarte o supernatante completamente sem perturbar a pelota celular.</li>
	<li>Transfira 0,5 μg de MRNA GFP quimicamente modificado (como repórter de transfecção) por 106 células B para a pelota celular (opcional).</li>
	<li>Resuspend a pelota celular com reagente de transfecção celular primária de 20 μL por 106 células B; misture suavemente por pipetar 5-6 vezes. Transfira 20,5 μL por reação de transfecção para o tubo de 0,2 mL da tira de 8 tubos contendo 2,5 μL do substrato de transfecção CRISPR/Cas9.</li>
	<li>Pipeta para cima e para baixo uma vez para misturar e transferir todo o volume (23 μL) em uma cuvette de transfecção. Cape e toque o cuvette no banco suavemente para garantir que o líquido cubra a parte inferior da cuvette.</li>
	<li>Use o protocolo de células B primárias humanas no nucleofector para transfecção. NOTA: O nucleofector (eletroporador) pode ser colocado e ser usado fora da capa da cultura tecidual. Tampe a cuvette para garantir a esterilidade.</li>
	<li>Descanse as células eletroporadas na cuvette em RT por 15 minutos.</li>
	<li>Transfira 80 μL do meio de expansão pré-equilibrada da célula B da placa de cultura tecidual para a reação de transfecção no cuvette. Coloque a cuvette na incubadora de cultura tecidual por 30 minutos.</li>
	<li>Pipeta suavemente algumas vezes para misturar e transferir todo o volume da amostra da cuvette para um poço apropriado de uma placa de cultura tecidual de 48 poços contendo 1 mL do meio de expansão de células B. A concentração final das células deve ser de 106 células/mL.</li>
	<li>Se realizar um experimento de GENE KI, transfira o vetor rAAV6 a 500.000 multiplicidade de infecção para o poço adequado contendo células eletroporadas (aproximadamente 45 min pós-eletroporação). Veja o exemplo rAAV6 vetor construto na Figura 4A. NOTA: Por exemplo: Uma amostra de controle será eletroporada sem o vetor CRISPR/Cas9 ou o vetor rAAV6. Uma amostra somente vetorial será eletroporada sem CRISPR/Cas9 e, em seguida, será transduzida com o vetor rAAV6. Uma amostra KI será eletroporada com CRISPR/Cas9 e, em seguida, será transduzida com o vetor rAAV6. rAAV6 deve conter braços de emologia para cima e para baixo do site DSB direcionado para HDR.</li>
	<li>Coloque a placa em uma incubadora de cultura tecidual a 37 °C e 5% de CO2 com umidade.</li>
	<li>Conte as células e regise viabilidade no primeiro dia pós-engenharia.</li>
	<li>Atualize o meio de expansão de células B a cada 2 dias contando as células e, em seguida, transferindo todo o volume das células para um tubo de microcentrifuge limpo de 1,5 mL. Centrifugar a 400 × g por 5 min, e descartar o supernasce sem perturbar a pelota. Resuspenque as células com 100 μL de meio de expansão de células B frescos, e transfira para um poço de uma placa de cultura tecidual de 24 poços. Levante o volume médio para alcançar uma concentração celular final em 5 × 105 células/mL. NOTA: Uma placa de 48 poços pode conter até 1 mL médio/bem; uma placa de 24 poços pode conter até 2 mL médio/bem; uma placa de 12 poços pode conter até 4 mL médio/bem, e uma placa de 6 poços pode conter até 8 mL médio/bem.</li>
	<li>Permita que as células projetadas se expandam por pelo menos 5 dias antes de realizar análises a jusante, como para análise de citometria de fluxo, análise de MARÉ e PCR de junção.</li>
</ol>

<ol>
	<li>LeBien, T. W., Thomas, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes:+how+they+develop+and+function.">B lymphocytes: how they develop and function.</a> Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).</li><li>Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+antibody-secreting+plasma+cells.">The generation of antibody-secreting plasma cells.</a> Nature Reviews Immunology. 15, 160-171 (2015).</li><li>Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. 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O., Porteus, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+integration+of+large+gene+cassettes+using+AAV+donor+vectors.">CRISPR-mediated integration of large gene cassettes using AAV donor vectors.</a> Cell Reports. 20 (3), 750-756 (2017).</li><li>Shirley, J. L., de Jong, Y. P., Terhorst, C., Herzog, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+viral+gene+therapy+vectors.">Immune responses to viral gene therapy vectors.</a> Molecular Therapy. 28 (3), 709-722 (2020).</li><li>Martino, A. T., Markusic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+mechanisms+against+AAV+vectors+in+animal+models.">Immune response mechanisms against AAV vectors in animal models.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 17, 198-208 (2020).</li></ol>

Uma patente foi registrada sobre os métodos de fabricação e uso de células B editadas por genoma com M.J.J, K.L., e B.S.M. como inventores. B.S.M é consultor e possui ações da Immusoft Inc. A Immusoft Inc. patrocinou pesquisas no laboratório da B.S.M.

A engenharia precisa do genoma em células B humanas primárias tem sido desafiadora até recentemente9,10. Já havia publicado protocolos usando o CRISPR/Cas9 para projetar células B humanas primárias9. Aqui, delineamos protocolos aprimorados para isolamento, expansão e engenharia de células B para permitir ko eficiente de CD19 ou para bater-in EGFP.
Aqui demonstramos que nosso protocolo de expans?...

As células B são um subgrupo da linhagem linfócito derivada de células-tronco hematopoiéticas. Eles desempenham um papel crítico no sistema imunológico humorálógico adaptativo, produzindo grandes quantidades de anticorpos em resposta aos desafios imunológicos1. As células B também são precursoras das células B da memória e das células plasmáticas de longa duração, com uma imunidade humoral duradoura2. As células plasmáticas, em particular, são únicas entre as células imunes em sua capacidade de produzir grandes quantidades de um anticorpo específico enquanto sobrevivem por anos ou décadas3. Além disso, a facilidade de isolamento do sangue periférico faz da linhagem de células B um excelente candidato para novas terapias baseadas em células4.
Anteriormente, métodos de integração aleatória, como aqueles que utilizam vetores lentivirais ou um transposon da Bela Adormecida, têm sido utilizados para projetar células B para entrega e expressão transgênicas5,6,7,8. No entanto, a natureza não específica dessas abordagens dificulta o estudo das funções biológicas de um gene específico nas células B e traz um risco inerente de mutagênese insercional e expressão transgênica variável e/ou silenciamento no cenário terapêutico.
O sistema CRISPR/Cas9 é uma poderosa ferramenta de engenharia de genomas que permite aos pesquisadores editar precisamente o genoma de várias células em inúmeras espécies. Recentemente, dois grupos, incluindo o nosso, desenvolveram com sucesso métodos de expansão ex vivo e engenharia de genomas direcionados das células B humanas primárias9,10. Descreveremos o processo de purificação das células B humanas primárias de uma amostra de leucemia. Depois disso, descreveremos nosso protocolo atualizado para expansão de células B e ativação de células B isoladas. Descreveremos então um processo para eliminar o cluster de diferenciação 19 (CD19), um receptor específico de células B e uma marca registrada das células B, por eletroporação para introduzir o CRISPR/Cas9 mRNA juntamente com o CD19 sgRNA em células B ativadas.
Cas9 mRNA é traduzido e se liga ao sgRNA CD19 para formar um complexo de ribonucleoproteína CRISPR/Cas9-sgRNA (RNP). Posteriormente, o sgRNA no complexo leva Cas9 a criar quebra de dois fios (DSB) na sequência de destino no exon 2 do gene. As células repararão o DSB por "junção final não homólogoa" introduzindo ou excluindo nucleotídeos, levando à mutação de mudança de quadro e fazendo com que o gene seja eliminado. Em seguida, mediremos a perda de CD19 por citometria de fluxo e analisaremos a formação indeléxica através do rastreamento de indelés por análise de decomposição (MARÉ).
Descreveremos então o processo de utilização do CRISPR/Cas9 juntamente com um vetor AAV6 recombinante (rAAV6, um modelo de doador para reparo direcionado à homologia (HDR)) para mediar a inserção específica do local da proteína fluorescente verde aprimorada(EGFP) no gene de integração do local de integração do vírus associado a Adeno 1 (AAVS1). O gene AAVS1 é um lócus ativo sem funções biológicas conhecidas e um local de integração viral AAV no genoma humano; portanto, é considerado um "porto seguro" para a engenharia do genoma. Aqui, relatamos que a expansão e ativação de células B permitiu uma expansão de até 44 vezes em 7 dias de cultura(Figura 1). A eletroporação das células B apresentou ligeira redução da saúde celular global (Figura 2A) em 24 h após a transfecção. A análise da parcela de dispersão do marcador CD19 (Figura 2B) mostrou uma redução de até 83% nas células editadas(Figura 2C).
A análise da MARÉ dos cromatógrafos (Figura 3A) revelou que o % indels foi semelhante à % perda de proteína por citometria de fluxo(Figura 3B). A análise da citometria de fluxo do experimento KI mostrou que as células que receberam vetor AAV (Figura 4),juntamente com RNP, expressaram até 64% células positivas de EGFP(Figura 5A)e posteriormente apresentaram integração bem sucedida por reação de cadeia de polimerase de junção (PCR) (Figura 5B). A contagem de células mostrou que todas as amostras se recuperaram rapidamente em 3 dias após a engenharia (Figura 5C).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug</td>
			<td>IDT</td>
			<td>1081059</td>
			<td>smaller size is also available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>V4XP-3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>118-156-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanCap chemically modified Cas9 mRNA</td>
			<td>Trilink Biotechnology</td>
			<td>L-7206-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>TLRL-2006-5</td>
			<td>different sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10, 100 mL</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>7930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS Immune Cell SR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2596101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep human B cells isolation kit</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>17954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience fixable viability dye eFlour 780</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excellerate B cell media, Xeno-free</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>CCM031</td>
			<td>B-cell basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>S11550</td>
			<td>For thawing B cells only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMate SnapStrip&#174; 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>T-3035-1 / 490003-692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS</td>
			<td>GE lifesciences</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lonza 4D Nucleofector core unit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lonza 4D Nucleofector X unit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1002X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mega CD40 Ligand</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-522-110-C010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1562-1EA</td>
			<td>For freezing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep 100X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TMS-AB2-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP anti-human CD19 clone HIB19</td>
			<td>biolegend</td>
			<td>302228</td>
			<td>smaller size is also available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.)</td>
			<td>Vigene Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-10 protein 250 ug</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>217-IL-250</td>
			<td>different sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-15 protein 25 ug</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>247-ILB-025</td>
			<td>different sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Big Easy EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>18001</td>
			<td>different sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA (TE) buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2476100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome engineering of primary human b cells using crispr/cas9

As células B são linfócitos derivados de células-tronco hematopoiéticas e são um componente-chave do braço humorístico do sistema imunológico adaptativo. Eles fazem candidatos atraentes para terapias baseadas em células devido à sua facilidade de isolamento do sangue periférico, sua capacidade de expandir in vitro e sua longevidade in vivo. Além disso, sua função biológica normal — para produzir grandes quantidades de anticorpos — pode ser utilizada para expressar quantidades muito grandes de uma proteína terapêutica, como um anticorpo recombinante para combater a infecção, ou uma enzima para o tratamento de enzimas. Aqui, fornecemos métodos detalhados para isolar células B humanas primárias de células mononucleares periféricas do sangue (PBMCs) e ativar/expandir células B isoladas in vitro. Em seguida, demonstramos as etapas envolvidas no uso do sistema CRISPR/Cas9 para ko específico do local de genes endógenos em células B. Este método permite um KO eficiente de vários genes, que podem ser usados para estudar as funções biológicas dos genes de interesse. Em seguida, demonstramos os passos para o uso do sistema CRISPR/Cas9 juntamente com um vetor recombinante, associado a adeno, viral (rAAV) para uma integração eficiente específica do local de um de expressão transgênica em células B. Em conjunto, este protocolo fornece uma plataforma de engenharia passo a passo que pode ser usada em células B humanas primárias para estudar funções biológicas de genes, bem como para o desenvolvimento de terapêuticas de células B.

O protocolo atualizado de expansão e ativação possibilitou a rápida expansão das células B em até 44 vezes em 7 dias(Figura 1; n =3 doadores). No experimento ko, a contagem de células B usando coloração azul Trypan mostrou mais de 80% de células viáveis com uma ligeira redução na recuperação celular tanto no controle quanto nas amostras de KO CD19 a 24 h pós-eletroporação(Figura 2A; p ≥ 0,05, n = 3 doadores). Este resultado indica que a elet...

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Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

Aqui fornecemos um protocolo detalhado passo a passo para a engenharia do genoma baseada em CRISPR/Cas9 das células B humanas primárias para nocaute genético (KO) e knock-in (KI) para estudar funções biológicas de genes em células B e o desenvolvimento de terapêuticas de células B.

Engenharia de Genoma de Células B Humanas Primárias Usando CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

genome-engineering-of-primary-human-b-cells-using-crisprcas9

Research

JoVE Journal

Biology

6.1K visualizações.  University of Minnesota. Aqui fornecemos um protocolo detalhado passo a passo para a engenharia do genoma baseada em CRISPR/Cas9 das células B humanas primárias para nocaute genético (KO) e knock-in (KI) para estudar funções biológicas de genes em células B e o desenvolvimento de terapêuticas de células B.

Vídeo: Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

Dissecação bruta e Multa de Ouvido Interno Epitélio sensorial em adultos Zebrafish ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Biologia

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

Geração de humanos CD40-activated células B

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Over the last decade, several adult stem cell populations have been identified in human skin 1-4. The isolation of multipotent adult dermal precursors was first reported by Miller F. D laboratory 5, 6. These early studies described a multipotent precursor cell population from adult mammalian dermis 5. These cells--termed SKPs, for skin-derived precursors-- were isolated and expanded from rodent and human skin and differentiated into both neural and mesodermal progeny, including cell types never found in skin, such as neurons 5. Immunocytochemical studies on cultured SKPs revealed that cells expressed vimentin and nestin, an intermediate filament protein expressed in neural and skeletal muscle precursors, in addition to fibronectin and multipotent stem cell markers 6. Until now, the adult stem cells population SKPs have been isolated from freshly collected mammalian skin biopsies.
Recently, we have established and reported that a population of skin derived precursor cells could remain present in primary fibroblast cultures established from skin biopsies 7. The assumption that a few somatic stem cells might reside in primary fibroblast cultures at early population doublings was based upon the following observations: (1) SKPs and primary fibroblast cultures are derived from the dermis, and therefore a small number of SKP cells could remain present in primary dermal fibroblast cultures and (2) primary fibroblast cultures grown from frozen aliquots that have been subjected to unfavorable temperature during storage or transfer contained a small number of cells that remained viable 7. These rare cells were able to expand and could be passaged several times. This observation suggested that a small number of cells with high proliferation potency and resistance to stress were present in human fibroblast cultures 7.
We took advantage of these findings to establish a protocol for rapid isolation of adult stem cells from primary fibroblast cultures that are readily available from tissue banks around the world (Figure 1). This method has important significance as it allows the isolation of precursor cells when skin samples are not accessible while fibroblast cultures may be available from tissue banks, thus, opening new opportunities to dissect the molecular mechanisms underlying rare genetic diseases as well as modeling diseases in a dish.

Na&amp;#239;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

We report a method to isolate na&#239;ve multipotent skin-derived precursor (SKP) cells from primary human fibroblast cultures. We show that these SKPs derived from fibroblast cultures share similar stem cell properties to the ones derived directly from human skin biopsies. These cells express the neural crest marker, nestin, in addition to the multipotent markers such as OCT4 and Nanog.

Naïve Adult Stem Cells isolamento de culturas primárias de fibroblastos humanos

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well as for modeling human diseases and testing therapeutic strategies. Recent advances in the use of designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system for site-specific genome engineering open the possibility to perform rapid targeted genome modification in virtually any laboratory species without the need to rely on embryonic stem (ES) cell technology. A genome editing experiment typically starts with identification of designer nuclease target sites within a gene of interest followed by construction of custom DNA-binding domains to direct nuclease activity to the investigator-defined genomic locus. Designer nuclease plasmids are in vitro transcribed to generate mRNA for microinjection of fertilized mouse oocytes. Here, we provide a protocol for achieving targeted genome modification by direct injection of TALEN mRNA into fertilized mouse oocytes.

Designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs) and transcription activator-like effector nucleases (TALENs) can be used to modify the genome of mouse preimplantation embryos by triggering both the nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR) pathways. These advances enable the rapid generation of mice with precise genetic modifications.

Rato Genoma Engenharia Usando Nucleases Designer

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory cells, EC cells sense luminal stimuli and convert them into serotonin (5-hyroxytryptamine, 5-HT) release events. However, the electrophysiology of these cells is poorly understood because they are difficult to culture and to identify. The method presented in this paper outlines primary EC cell cultures optimized for single cell electrophysiology. This protocol utilizes a transgenic cyan fluorescent protein (CFP) reporter to identify mouse EC cells in mixed primary cultures, advancing the approach to obtaining high-quality recordings of whole cell electrophysiology in voltage- and current-clamp modes.

Enterochromaffin (EC) cells comprise a small subset of gastrointestinal epithelial cells. EC cells are electrically excitable and release serotonin, yet difficulties in culturing and identifying EC cells have limited physiological studies. The method presented here establishes a primary culture model amenable to examination of single EC cells by electrophysiology.

Eletrofisiologia celular de células enterocromafins murino culta primário

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these independently derived phenotypes, which share a common genetic architecture. This is perhaps best exemplified by the numerous convergent features of gymnotiforms and mormyrids, two species-rich teleost clades that produce and detect weak electric fields and are called weakly electric fish. In the 50 years since the discovery that weakly electric fish use electricity to sense their surroundings and communicate, a growing community of scientists has gained tremendous insights into evolution of development, systems and circuits neuroscience, cellular physiology, ecology, evolutionary biology, and behavior. More recently, there has been a proliferation of genomic resources for electric fish. Use of these resources has already facilitated important insights with regards to the connection between genotype and phenotype in these species. A major obstacle to integrating genomics data with phenotypic data of weakly electric fish is a present lack of functional genomics tools. We report here a full protocol for performing CRISPR/Cas9 mutagenesis that utilizes endogenous DNA repair mechanisms in weakly electric fish. We demonstrate that this protocol is equally effective in both the mormyrid species Brienomyrus brachyistius and the gymnotiform Brachyhypopomus gauderio by using CRISPR/Cas9 to target indels and point mutations in the first exon of the sodium channel gene scn4aa. Using this protocol, embryos from both species were obtained and genotyped to confirm that the predicted mutations in the first exon of the sodium channel scn4aa were present. The knock-out success phenotype was confirmed with recordings showing reduced electric organ discharge amplitudes when compared to uninjected size-matched controls.

Here, a protocol is presented to produce and rear CRISPR/Cas9 genome knockout electric fish. Outlined in detail are the required molecular biology, breeding, and husbandry requirements for both a gymnotiform and a mormyrid, and injection techniques to produce Cas9-induced indel F0 larvae.

Silenciando a faísca: Edição do genoma CRISPR/Cas9 em peixes fraca elétricos

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by filarial nematodes such as canine heartworm and elephantasis. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been used to induce site-directed mutations by injecting a Cas9 protein that has been complexed with a guide RNA (gRNA) into freshly laid embryos of several insect species, including mosquitoes that belong to the genera Anopheles and Aedes. Manipulating and injecting Culex mosquitoes is slightly more difficult as these mosquitoes lay their eggs upright in rafts rather than individually like other species of mosquitoes. Here we describe how to design gRNAs, complex them with Cas9 protein, induce female mosquitoes of Culex pipiens to lay eggs, and how to prepare and inject newly laid embryos for microinjection with Cas9/gRNA. We also describe how to rear and screen injected mosquitoes for the desired mutation. The representative results demonstrate that this technique can be used to induce site-directed mutations in the genome of Culex mosquitoes and, with slight modifications, can be used to generate null-mutants in other mosquito species as well.&#160;

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is increasingly used to characterize gene function in non-model organisms. This protocol describes how to generate knock-out lines of Culex pipiens, from preparing injection mixes, to obtaining and injecting mosquito embryos, as well as how to rear, cross, and screen injected mosquitoes and their progeny for desired mutations.

Preparando e injetando embriões de mosquitos Culex para gerar mutações nulas usando CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an important research model for insect metamorphosis. The CRISPR/Cas9 system can accurately locate at a specific DNA locus and cleave within the target site, efficiently introducing double-strand breaks to induce target gene knockout or integrate new gene fragments into the specific locus. CRISPR/Cas9-mediated genome editing is a powerful tool for addressing questions encountered in locust research as well as a promising technology for locust control. This study provides a systematic protocol for CRISPR/Cas9-mediated gene knockout with the complex of Cas9 protein and single guide RNAs (sgRNAs) in migratory locusts. The selection of target sites and design of sgRNA are described in detail, followed by in vitro synthesis and verification of the sgRNAs. Subsequent procedures include egg raft collection and tanned-egg separation to achieve successful microinjection with low mortality rate, egg culture,&#160;preliminary estimation of the mutation rate, locust breeding as well as detection, preservation, and passage of the mutants to ensure population stability of the edited locusts. This method can be used as a reference for CRISPR/Cas9 based gene editing applications in migratory locusts as well as in other insects.

This study provides a systematically optimized procedure of CRISPR/Cas9 ribonuclease-based construction of homozygous locust mutants as well as a detailed method for cryopreservation and resuscitation of the locust eggs.

Construção de mutantes homozigotos de gafanhotos migratórios utilizando tecnologia CRISPR/Cas9

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells for Gene Therapy Applications

CRISPR/Cas9 is a highly versatile and efficient gene-editing tool adopted widely to correct various genetic mutations. The feasibility of gene manipulation of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) in vitro makes HSPCs an ideal target cell for gene therapy. However, HSPCs moderately lose their engraftment and multilineage repopulation potential in ex vivo culture. In the present study, ideal culture conditions are described that improves HSPC engraftment and generate an increased number of gene-modified cells in vivo. The current report displays optimized in vitro culture conditions, including the type of culture media, unique small molecule cocktail supplementation, cytokine concentration, cell culture plates, and culture density. In addition to that, an optimized HSPC gene-editing procedure, along with the validation of the gene-editing events, are provided. For in vivo validation, the gene-edited HSPCs infusion and post-engraftment analysis in mouse recipients are displayed. The results demonstrated that the culture system increased the frequency of functional HSCs in vitro, resulting in robust engraftment of gene-edited cells in vivo.

The present protocol describes an optimized hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) culture procedure for the robust engraftment of gene-edited cells in vivo.

Edição de Genes CRISPR/Cas9 de Células-Tronco Hematopoiéticas e Progenitoras para Aplicações de Terapia Gênica

CRISPR/Cas9 is a highly versatile and efficient gene-editing tool adopted widely to correct various genetic mutations. The feasibility of gene ...

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops worldwide. Since adult fruit flies have great flight capacity and females lay their eggs under the skins of fruit, insecticides requiring direct contact with the pest usually perform poorly in the field. With the development of molecular biological tools and high-throughput sequencing technology, many scientists are attempting to develop environmentally friendly pest management strategies. These include RNAi or gene editing-based pesticides that downregulate or silence genes (molecular targets), such as olfactory genes involved in searching behavior, in various insect pests. To adapt these strategies for Oriental fruit fly control, effective methods for functional gene research are needed. Genes with critical functions in the survival and reproduction of B. dorsalis serve as good molecular targets for gene knockdown and/or silencing. The CRISPR/Cas9 system is a reliable technique used for gene editing, especially in insects. This paper presents a systematic method for CRISPR/Cas9 mutagenesis of B. dorsalis, including the design and synthesis of guide RNAs, collecting embryos, embryo injection, insect rearing, and mutant screening. These protocols will serve as a useful guide for generating mutant flies for researchers interested in functional gene studies in B. dorsalis.

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

This paper presents the step-by-step protocols for CRISPR/Cas9 mutagenesis of the Oriental fruit fly Bactrocera dorsalis. Detailed steps provided by this standardized protocol will serve as a useful guide for generating mutant flies for functional gene studies in B. dorsalis.

Protocolos para a Mutagênese CRISPR/Cas9 da Mosca da Fruta Oriental Bactrocera dorsalis

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops ...