私たちのプロトコルは、研究者が3つの異なる骨髄移植方法の生理学的影響と、それらがクローン造造りの設定における実験的結果にどのような影響を与えるかを理解するのに役立ちます。全身放射線骨髄移植は、心血管器官に悪影響を及ぼし、疾患の病態を変える可能性があります。このように、我々の研究室は、副作用の可能性を最小限に抑える、または回避するための2つの代替方法を開発しました。
手順を実証するのは、大学院生のウンビーパークと、私の研究室の博士研究員のメーガン・エヴァンスが、私の研究室から胸郭と腹部のシールドのために、調整可能なトレイとX線照射器を正しい距離に置いて均一な照射を達成します。そして、麻酔マウスを平らな導いたプレートに置き、より大きな位置に互いに反転させた。テープでプレートに足を固定し、下端がキシヒステルナム骨と整列し、リードシールドの上端が胸腺の近くに座るように導いたシールドを配置します。
遮蔽後、マウスを照射器に入れ、動物を4〜24時間間隔で分離した2、5.5グレイの照射分画に曝露する。ヘッドシールドのために、慎重に腹部にマウスの4つの足をテープ。マウスを円錐型の拘束器に置き、リードシールド内のスロットに拘束剤をスライドさせて、マウスの頭と耳が完全に覆われて、残りのマウスの体を放射線のために露出させます。
マウスを照射器に入れて、動物を曝露した後、4〜24時間間隔で分離された放射線の5.5グレイの画分に。各放射線治療の後、麻酔をしたマウスを完全に回復するまで監視と加熱されたマットのケージに入れます。骨を単離するには、70%エタノールでドナーマウスの皮膚を消毒し、リブケージの下に小さな横皮切開を行います。
切開の両側で皮膚をしっかりと保持し、頭と足に向かって反対方向に引き裂き、すべての手足から皮膚を剥がします。肩と肘の関節を切り取り、ラボワイプを使用して、付着した筋肉や結合組織を上腕骨から取り除きます。大腿骨と股関節の間の関節を慎重に外します。
そして、脚を取り外すために大腿骨の頭に沿ってカットするために鈍いはさみを使用してください。膝関節を切り取り、大腿骨と脛骨を分離する。そして、慎重に骨から取り付けられた筋肉や結合組織を除去するためにラボワイプを使用してください。
その後、同じ遺伝子型のマウスから、氷の上に20ミリリットルの氷冷滅菌PBSを含む個々の50ミリリットルの円錐管に骨を引き込みます。バイオセーフティクラス2キャビネットで骨髄細胞を分離するには、18ゲージの針を使用して、滅菌500マイクロチューブの底部に小さな穴を開けます。そして、氷冷滅菌PBSの100マイクロリットルを含む個々の無菌1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブにチューブを置きます。
すべてのチューブが準備されたら、分離された骨を含むチューブからPBSを取り出し、滅菌100ミリメートル細胞培養皿に骨を移します。細かい鉗子と小さいはさみを使用して、各骨の端部から骨外を慎重に取り除き、各500マイクロリットルチューブに最大6本の骨を入れる。すべての骨が切断されたら、遠心分離によって骨髄細胞を抽出します。
すべての骨髄内容物が除去された場合、骨は1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管の底に比較的大きな赤いペレットで白く半透明に見えるはずです。骨髄細胞移植の場合、分離した骨髄細胞を血清フリーRPMI培地で希釈し、200マイクロリットルの細胞懸濁液を1本の0.5ミリリットルのインスリン注射器に注入して注射する。ペダル反射に対する応答の欠如を確認した後、各麻酔付きレシピエント動物のレトロな軌道静脈に細胞の全容をゆっくりと注入する。
その後、痛みの軽減のために目にプロパラカインの滴を置きます。そして、マウスが監視されている間に意識を取り戻すことを可能にします。ドナー細胞生着に対する3つのBMT予備調整方法の効果を比較する。
末梢血および心臓組織におけるドナー細胞の画分を、BMT後1ヶ月でフローサイトメトリーによって分析した。本代表分析では、全身照射を受けたレシピエントマウスの末梢血において、単球、好中球およびB細胞を大部分がアブラ化し、ドナー骨髄由来細胞の子孫に置換された。さらに、常駐する心臓単球および好中球集団は、ドナー由来細胞にほぼ完全に置き換えられた。
部分的にシールドされた照射群では、ドナー由来の心臓免疫細胞置換は控えめであった。シールド領域内のレシピエントマウス骨髄細胞は、全身照射を受けたマウスと比較して、末梢血再構成の低レベルに寄与した可能性が高い。BMT予備調整を行わない群では、ドナー由来細胞は、BMT後4週間でレシピエントマウスの末梢血および心臓で検出可能であった。
さらに、Tet2欠損ドナー細胞は徐々に徐々に拡大した。それに比べて、野生型ドナー細胞を有するレシピエントマウスは、ドナー細胞のクローン拡張を最小限に抑えた。これらの実験モデルの最適化は、カーディオ代謝疾患や癌などのすべての原因の死亡率に寄与するクローン造図ドライバー遺伝子のより厳格な研究を可能にする。
私たちのプロトコルは、研究者がクローン造造を研究し、それが心血管疾患やその他の疾患状態にどのように寄与するかを調査することを望んでいます。
