私たちは、手続きのフィギュアデザインとデモの支援のためにRoxannエテュ-アーバーに感謝しています。ラボでの研究が発見はありません付与、コール財団からの移行賞によってサポートされていました。自然科学とカナダの工学研究評議会（NSERC）とイノベーションのためのカナダ基金（CFIリーダーファンドはありません。31377を付与）419226から2012。サンテ（FRQS） - KMHは、フォンデRECHERCHEケベックためChercheur-Boursierジュニアです。

このプロトコルで説明されているすべての手順は、制度上の動物の倫理委員会によって承認され、動物実験ガイドラインにカナダの評議会に従ってきました。 注意：滅菌/特定病原体フリーの住宅事情を維持するために、生物学的安全キャビネットまたは層流フードの内側に生きたマウスのダイレクトなハンドリングに関連するすべての手続きを行っています。適切に動物に提供される装置、住宅資材、飼料と水を抑制し、クリーンまたはケージを滅菌します。注射のための血液採取のためにのみ、滅菌、使い捨ての針を使用してください。無菌技術は、移植の準備中に重要です。 レシピエントマウスの作製<ol><li>時間をかけて末梢血および骨髄再構成の個々のフォローアップを有効にするには、耳のノッチ（またはローカルの動物倫理委員会8によって承認された他の方法）とレシピエントマウスを識別します。移植後のフォローアップのためのマウスを計量。米国（25g未満）7〜12週齢での電子のレシピエントマウス。 注：提供された例では、CD45.1 + CD45.2 +レシピエントマウスは、コンジェニックB6.SJLマウスとC57BL / 6マウスを交配することによって家の中で飼育しました。 </li><li>造血活性を破壊するために450ラドの2用量でレシピエントマウスに照射。移植前、移植の前に最初の投与日及び第二の1〜2時間を与えます。 注：X線またはガンマ線は、両方の適切な設備の利用可能性に応じて使用することができます。 </li></ol>ドナーと競合骨髄細胞の調製<ol><li>ドナー（試験および対照を、CD45.2 +）を安楽死させると、競合他社（CD45.1 +; B6.SJL）頸椎脱臼や地元の動物倫理委員会によって承認された方法を用いて、続いてCO 2窒息によりマウス。 </li><li>空のペトリ皿中または滅菌ガーゼ上で、オープン広い背中、足にマウスを置き、私は（清潔な作業面を維持します）生物学的安全キャビネットをnside。 70％エタノール/ 30％Hと皮膚と毛を湿ら2 O（v / v）です。 </li><li>手術用ブレードまたは鋭いハサミで足を切断してください。脚部に沿って皮膚を開き、鋸歯状の鉗子を用いて皮膚を引き離すカット。余分な筋肉を切り取ります。 </li><li>足の骨を引っ張ると反力として骨盤に対してはさみの刃を使用して大腿骨を脱臼。膝頭から脛骨と大腿骨を外し、筋肉や腱の残りのビットを削除します。 6ウェル組織培養プレート2-3ミリリットル中に骨を滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を配置。 </li><li> 5ミリリットル滅菌PBSで骨を洗い流すことによって骨髄細胞を収集します。 <ol><li>ピンセットで軽く骨を持ち、骨の一端に満たした1mlシリンジに取り付けた25 Gの針を挿入します。プランジ​​ャーを押して、15ミリリットルコニカルチューブに細胞を収集します。骨の中心が白になるまで、必要に応じて繰り返します。 </li></ol></li><li>繰り返しに針を通すことにより細胞を解離単一細胞懸濁液を得ます。気泡や過剰な力を避けてください。注：この段階で、細胞生存率を改善するために、わずかに大きい針（22 G）を使用します。 </li><li>均一な細胞懸濁液を確実にし、破片や凝集塊を除去するために70μmのナイロンストレーナを介して細胞を渡します。 </li><li>血球計数器を用いて細胞計数のためにアリコートを削除します。 4℃で5分間、200×gで、残りの細胞懸濁液を遠心。滅菌PBS（10 8細胞/ ml）に、必要に応じて細胞密度を再調整します。細胞を氷上に保管してください。 </li></ol> 3.ドナー細胞HSC同等の確立<ol><li>フローサイトメトリー染色のために5ミリリットル丸底ポリスチレンチューブに3×10 6個の細胞（30μL）と同等のものを転送します。 （2.5 / mlの最終濃度（PBS、0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）および1mM EDTAを補充した）、染色緩衝液で希釈）、非特異的染色をブロックするためにCD16 / CD32に対する非標識抗体の等量を加えます。 RTで5分間インキュベート。 </li><li> 、ビオチン化リネージュカクテル（B220、CD3e、のCD11b、GR1、TER119）のSca1、CD117、CD135、CD150：染色緩衝液中で調製90μlの蛍光標識抗体のマスターミックスを追加します。光から保護して30分間、氷上でインキュベートします。 注：適切な希釈は、抗体のロットごとに決定されるべきです。本研究で用いた希釈液のための材料の表を参照してください。 </li><li>未結合抗体を除去するために4℃で5分間、200×gで細胞、ボルテックスおよび遠心分離に2ミリリットルの染色バッファーを追加します。フリックにより上清と再懸濁ペレットをデカント。 </li><li>染色緩衝液で希釈した10μlの蛍光色素結合ストレプトアビジンは（ 材料表を参照）を追加します。光から保護し、20分間、氷上でインキュベートします。未結合ストレプトアビジンを除去するためのステップ3.3のように洗ってください。 </li><li>少なくとも6つの検出器9とフローサイトメーターを用いて細胞サンプルを取得します。林の周波数を決定する-のSca1 + CD117 + CD135 - CD150 <su解析テンプレートを使用して、各試料中のp&gt; +細胞（HSCを推定） 図2に示すように、以前に10,11を報告しました 。 注意：その集団内の機能HSCの頻度は1/3と1/5 2,12の間に推定することができます。 </li><li>以下および図2で説明するように、ベースラインのような1つのサンプル（典型的には、競合他社、この例ではB6.SJL CD45.1 +）を使用して、すべてのサンプル11の推定HSC当量を確立します。 <ol><li>以下の式を使用して、必要な細胞の数を計算します。 HSCを#transplanted /受信者= 5×10 5細胞のxは（ベースラインサンプルのために決定されるように、この数は、野生型C57BL / 6マウスを、75と125の間に通常ある）HSC頻度を推定10-12。 注： 図2では、試料Aのために、結果は139のHSCです。 （他のサンプルのため、 図2の例のサンプルB）の合計＃移植された細胞=＃トランスHSC / HSC頻度を植えました。 注： 図2では、試料Bの場合、結果は197826（または約2×10 5）総骨髄細胞です。 </li></ol></li><li>上記で得られた結果を用いて、各サンプルのため移植片受容者ごとに必要な細胞の総数を計算します。 注意：この数は、ベースラインサンプル（競合他社）のために5×10 5であるべきです。 <ol><li>レシピエントマウスの数でステップ3.7から得られた数を乗算し、シリンジ内のデッドボリュームを補うために、少なくとも2つのさらなるマウスについての十分な細胞を追加します。 </li></ol></li><li>ステップ3.6で計算され、滅菌PBSを使用して、注射当たり200μlのための最終的な音量を調整すると1 HSC当量比：（ 例えば 、CD45.1 +）競合他社と1の試験細胞（CD45.2 +）を混ぜます。 注：5レシピエントマウスのグループが提案ボリュームは、このように3.5×10 6競技者の骨髄細胞を含有する1.4以上mlである（またはであろうために973 図2のサンプルA）の推定のHSC、およびテストセルの等価数は（ 図2に、サンプルBの等価）は197826×7 = 1384782骨髄細胞であろう。 </li></ol> 4.骨髄移植<ol><li>血管の拡張を確実にするために、横尾静脈をより見やすくするために、赤加熱ランプとステップ1.2で照射レシピエントマウスをウォームアップ。 </li><li> 27 G針（または小さい）を装備した1ミリリットルツベルクリン注射器を準備します。吸引し（3レシピエントマウス用）調製した細胞懸濁液の約750μlの。シリンジ内に気泡がないことを確認してください。 </li><li>拘束装置にマウスを挿入します。尾を調べ、尾の両側にはっきりと見えるはず外側尾静脈を探します。エタノールで注射部位を拭きます。 、アップベベル針を挿入し、皮膚に平行で、静かにプランジャーを押してください。注射は簡単にする必要があります。力再ある場合quiredは、針が静脈ではありません。 注意：古いマウスは厚い皮を持って、より困難な静脈を見つけることができます。針が静脈内にない場合は、最初の注射部位に注射針の近位を挿入します。 </li><li>針を外し、出血を止めるために数秒間滅菌ガーゼで注射部位を押してください。きれいなケージにマウスを転送します。 注意：針があまりにも鈍くなることがあり、その後3回の注射のために同じ注射器と針を使用してください。 </li><li>移植後のフォローアップのために、最初の5日間、マウスを再水和するために滅菌PBSを皮下1ミリリットルを注入。感染を防ぐために水を飲んで抗生物質を追加します（必要に応じて、オプション）。最初の3週間は2〜3日ごとにマウスを計量し、その移植前の体重（またはローカルの動物倫理委員会によって決定される）以上の15から20までパーセントを失ったマウスを安楽死させます。 </li></ol>末梢血の5.分析<ol><li>一滴の血液を収集する（Approx。 EDTAチューブに50-100μl）を。 <ol><li>下顎静脈から血液を採取するには、顎骨の下に位置するヘアレススポットに近い顔の皮膚を穿刺し、血液13の滴を受け取るために捕集管を配置するために、ランセットまたは22 G針を使用しています。多系列再構成に従うように、移植後4、8、12および16週目に血液を採取します。 </li></ol></li><li>ステップ5.1.1で採取した血液の低下に1ミリリットル新たに調製したRT赤血球溶解バッファー（9部0.16 M NH 4 Clで+ 1部0.17 Mトリス塩酸pHは7.65）を追加します。混合し、フローサイトメトリーに適した5ミリリットルの丸底ポリスチレンチューブにサンプルを移します。 RTで4分間放置してみましょう。 </li><li>氷冷PBSの4ボリュームを追加します。エンド・ツー・エンドを回して混合し、氷上ですぐに転送します。 4℃で200×gで遠心分離10分。 </li><li>フリックにより上清と再懸濁ペレットをデカント。上清を明確にし、赤でなければなりません。簡単にバッファと渦を染色2ミリリットルを追加します。 200 XGAで5分間遠心トン4°C。 </li><li>フリックにより上清と再懸濁ペレットをデカント。 </li><li> CD45.1、CD45.2、CD3e、CD19、GR1：ステップ3.3から3.1に詳述さ一般的なプロトコルを使用して染色、フローサイトメトリーと、次のマスターミックスのための抗体を続行します。 </li><li>少なくとも6つの検出器9とフローサイトメーターを用いて細胞サンプルを取得します。 図3に設けられた分析テンプレートを使用して、各試料中の各系統（CD19 + Bリンパ球、CD3e + Tリンパ球、GR1 明るい顆粒球）および10,11を公開としてドナー由来細胞の頻度を決定します。 </li></ol>骨髄再構成の6分析<ol><li>部2ステインにマスターミックスのためのステップ3.3から3.1に詳述さ一般的なプロトコルを使用してフローサイトメトリー分析のための細胞と以下の抗体を詳述したように骨髄細胞を収集：リネージュカクテル、のSca1、CD117、CD135、CD150、CD45.1 、CD45.2。 LINを検出ステップ3.4で説明したように蛍光色素結合ストレプトアビジンを使用してEAGEカクテル抗体。 </li><li>少なくとも8の検出器9とフローサイトメーターを用いて細胞サンプルを取得します。のみ6が利用可能な場合はCD135 +細胞が除外されるように、系統パネルと同じチャンネルにCD135を追加します。 図4に、10が公開され提供される分析テンプレートを使用して、各サンプル中のCD150 +のHSC -のSca1 + CD117 + CD135 -ドナー由来林の周波数を決定します。 </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

ここで説明するプロトコルは、既知の競合他社のHSCに対するドナー（テスト）HSCの相対的な適合性を評価するために設計されています。競争の状況は（幹細胞のフィットネスの緩やかな減少を検出する可能性が高い）アッセイの相対感度を向上させ、照射し、注射の有効性のための内部の技術的な制御を提供します。しかし、それはHSCのフィットネスの絶対的な尺度として使用されるべきで?...

造血が損傷、放射線と細胞死によって失われた血液細胞の補充を確実に再生プロセスです。この処理は、主に成人の骨髄に存在する造血幹細胞（HSC）によって保証されます。また、造血幹細胞は、自己免疫疾患、血液悪性腫瘍および免疫不全1で治療目的のために使用することができます。よりよいそれらの増殖拡大と到達し、移植後のレシピエントの骨髄を生着する能力を含む、HSC機能を制御する機構を理解する必要性が存在します。最近の研究は、将来に向かって約50％の純度2-4に大人のHSCおよび胎児HSCを豊かにするSLAMファミリーメンバーCD150及びCD48を含むいくつかの細胞表面マーカーを、報告しているが、機能的な造血幹細胞のためのゴールドスタンダード尺度はへのin vivo再増殖アッセイのまま血液cを再確立する能力を決定します照射されたホスト5のエル生産。 in vivoでのクローン再増殖アッセイは、最初にティルとマカロック6が開発し、以来、洗練され、拡張されました。もともと定義されているように、HSCは自己複製と分化を通じて生涯の血液細胞の生産を確保します。異なる血液細胞系統（Tリンパ球、Bリンパ球、顆粒球、単球）、および連続移植を介して、自己再生能力の分析を介して分化する能力を：照射レシピエントへのHSCの転送は、このように我々が評価することを可能にします。アッセイは、通常、機能性および/ ​​またはHSCの2つの集団の量の比較を伴うだろう、 例えば 、細胞が造血幹細胞の維持や拡大に影響を与える可能性が別の因子で処理または未処理された異なる遺伝子型または細胞の2匹のマウスから来ます文化インチドナーキメラ、または転送されたドナーのHSCトンの貢献O血液細胞産生は、受信者、またはホストからのドナー細胞を区別する細胞表面マーカーまたは他の方法を用いて、末梢血および骨髄にフローサイトメトリー解析によって決定することができます。最も広く使用されているマーカーは確かに私たちは下記の実施例のために選択した遺伝子PtprcまたはCD45白血球抗原7のための2つの対立遺伝子です。 クローン再増殖アッセイは、競合的または非競合的のいずれかであることができます。非競合的設定では、対照および試験HSCは別個のレシピエントマウスに移し、各細胞型のための結果は、他の独立したであろう。競争力のある設定では、試験および対照両方HSCの機能は、競合他社HSCの集団に対して測定されます。ここで説明するプロトコルは、競争力のある設定を使用しても、非競合的状況に適合させることができます。どちらのアプローチは、その利点と限界を持っている、と私たちは中に詳細にそれらを比較します討論。我々はまた、移植されたHSCの数の株式を確保するための様々なアプローチを説明し、希釈アッセイ（LDA）を制限することにより、HSCの定量化のためのアッセイを適合させ、結果の解釈のための成功と失敗の移植の両方の例を提供する方法について説明します。

<table><tbody><tr><td>Microtainer tubes with K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;EDTA</td><td>BD Biosciences</td><td>365974</td><td></td></tr><tr><td>20 G needle</td><td>BD Syringe</td><td></td><td>For blood sampling from the mandibular vein</td></tr><tr><td>LabQuake Shaker rotisserie</td><td>Thermo&amp;nbsp; Scientific</td><td>C415110</td><td></td></tr><tr><td>Purified anti-mouse CD16/CD32 (clone 2.4G2, Fc Block)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>2.50 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Pe-Cy7-conjugated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11)</td><td>eBioscience</td><td>25-0031</td><td>0.25 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>PE-conjugated anti-mouse CD19 (clone 1D3)</td><td>eBioscience</td><td>12-0193</td><td>0.25 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>APC-eFluor780 (APC-Cy7 equivalent)-conjugated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5)</td><td>eBioscience</td><td>47-5931</td><td>0.25 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>FITC-conjugate anti-mouse CD45.1 (clone A20)</td><td>eBioscience</td><td>11-0453</td><td>2.50 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>eFluor450-conjugated anti-mouse CD45.2 (clone 104)</td><td>eBioscience</td><td>48-0454</td><td>1.00 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Biotinylated anti-human/mouse CD45R (B220) (clone RA3-6B2)</td><td>eBioscience</td><td>13-0452</td><td>1.25 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Biotinylated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11)</td><td>eBioscience</td><td>13-0031</td><td>1.25 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Biotinylated anti-mouse CD11b (clone M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>13-0112</td><td>1.25 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Biotinylated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5)</td><td>eBioscience</td><td>13-5931</td><td>1.25 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Biotinylated anti-mouse TER119 (clone TER119)</td><td>eBioscience</td><td>13-5921</td><td>0.625 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>V500 streptavidin</td><td>BD Biosciences</td><td>56149</td><td>0.5 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>PE-conjugated anti-mouse CD117 (clone 2B8)</td><td>BD Biosciences</td><td>553355</td><td>0.25 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>PE-Cy7-conjugated anti-mouse Ly6A/E (Sca1) (clone D7)</td><td>BD Biosciences</td><td>558162</td><td>0.25 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>PerCP-eFluor710-conjugated anti-mouse CD135 (clone A2F10)</td><td>eBioscience</td><td>46-1351</td><td>0.5 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Alexa fluor 647-conjugated anti-mouse CD150 (clone TC15-12F12.2)</td><td>Biolegend</td><td>115918</td><td>0.625 &amp;mu;g/ml
BD Biosciences and eBioscience do not carry the same clone</td></tr><tr><td>1 ml tuberculin syringe with 27 G needle</td><td>BD Syringe</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>1 ml tuberculin syringe with 25 G needle</td><td>BD Syringe</td><td>309626</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m cell strainer</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr></tbody></table>

competitive transplants to evaluate hematopoietic stem cell fitness

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to reestablish blood cell production for the lifespan of the recipient. This protocol explains how to set up a functional assay to compare the HSC capacities of two different populations of cells, such as bone marrow from mice of two different genotypes, and how to analyze the recipient mice by flow cytometry. The protocol uses HSC equivalents rather than cell sorting for standardization and discusses the advantages and disadvantages of both approaches. We further discuss different variations to the basic protocol, including serial transplants, limiting dilution assays, homing assays and non-competitive transplants, including the advantages and preferred uses of these varied approaches. These assays are central for the study of HSC function and could be used not only for the investigation of fundamental HSC intrinsic aspects of biology but also for the development of preclinical assays for bone marrow transplant and HSC expansion in culture.

二次移植（さらに後述）を含む競争力の移植設定の一般的な説明は、 図1に見出すことができる。移植前の骨髄のHSCのための代表的な分析は、図2に記載されています。ダブレットの除外に関するより詳細な情報と死んだ細胞は、他の場所9見つけることができます。 図3及び<st...

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Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness

This protocol provides step-by-step guidelines for setting up competitive mouse bone marrow transplant experiments to study hematopoietic stem/progenitor cell function without prior purification of stem cells by cell sorting.

競争力の移植は、造血幹細胞のフィットネスを評価します

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to ...

competitive-transplants-to-evaluate-hematopoietic-stem-cell-fitness

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

15.2K ビュー.  Institut National de la Recherche Scientifique. This protocol provides step-by-step guidelines for setting up competitive mouse bone marrow transplant experiments to study hematopoietic stem/progenitor cell function without prior purification of stem cells by cell sorting. 

ビデオ: Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness

Transduction-Transplantation Mouse Model of Myeloproliferative Neoplasm

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the gene of interest in hematopoietic cells and can be used to study the gene's role in normal and/or malignant hematopoiesis. This protocol provides a detailed description on how to perform transduction-transplantation using calreticulin (CALR) mutations recently identified in myeloproliferative neoplasm (MPN) as an example. In this protocol whole bone marrow cells from 5-flurouracil (5-FU) treated donor mice are transduced with a retrovirus encoding mutant CALR and transplanted into lethally irradiated syngeneic hosts. Donor cells expressing mutant CALR are marked with green fluorescent protein (GFP). Transplanted mice develop an MPN phenotype including elevated platelets in the peripheral blood, expansion of megakaryocytes in the bone marrow, and bone marrow fibrosis. We provide a step-by-step account of how to generate retrovirus, calculate viral titer, transduce whole bone marrow cells, and transplant into irradiated recipient mice.

This manuscript provides a description of the methodology used to establish transduction-transplantation mouse models. A detailed account is given of technical errors to avoid when performing bone marrow transplants. A clear understanding should be gained of the importance of high viral titer, transfection/transduction, and irradiation.

骨髄増殖性腫瘍の形質導入 - 移植マウスモデル

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the ...

がん研究

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules that regulate HSCs. In these transplant model systems, the function of HSCs is determined by the ability of these cells to engraft and reconstitute lethally irradiated recipient mice. Commonly, the donor cell contribution/engraftment is measured by antibodies to donor- specific cell surface proteins using flow cytometry. However, this method heavily depends on the specificity and the ability of the cell surface marker to differentiate donor-derived cells from recipient-originated cells, which may not be available for all mouse strains. Considering the various backgrounds of genetically modified mouse strains in the market, this cell surface/ flow cytometry-based method has significant limitations especially in mouse strains that lack well-defined surface markers to separate donor cells from congenic recipient cells. Here, we reported a PCR-based technique to determine donor cell engraftment/contribution in transplant recipient mice. We transplanted male donor bone marrow HSCs to lethally irradiated congenic female mice. Peripheral blood samples were collected at different time points post transplantation. Bone marrow samples were obtained at the end of the experiments. Genomic DNA was isolated and the Y chromosome specific gene, Zfy1, was amplified using quantitative Real time PCR. The engraftment of male donor-derived cells in the female recipient mice was calculated against standard curve with known percentage of male vs. female DNAs. Bcl2 was used as a reference gene to normalize the total DNA amount. Our data suggested that this approach reliably determines donor cell engraftment and provides a useful, yet simple method in measuring hematopoietic cell reconstitution in murine bone marrow transplantation models. Our method can be routinely performed in most laboratories because no costly equipment such as flow cytometry is required.

Determining donor cell engraftment presents a challenge in mouse bone marrow transplant models that lack well-defined phenotypical markers. We described a methodology to quantify male donor cell engraftment in female transplant recipient mice. This method can be used in all mouse strains for the study of HSC functions.

競争力のあるマウス骨髄移植モデルにおけるドナー細胞の生着を​​決定するために、定量的リアルタイムPCRを用いて

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

医学

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early embryo and the lack of assays that functionally identify the long-term multilineage engraftment potential of individual putative HSC precursors. Here, we describe methodology that enables the isolation and characterization of functionally validated HSC precursors at the single cell level. First, we utilize index sorting to catalog the precise phenotypic parameter of each individually sorted cell, using a combination of phenotypic markers to enrich for HSC precursors with additional markers for experimental analysis. Second, each index-sorted cell is co-cultured with vascular niche stroma from the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, which supports the maturation of non-engrafting HSC precursors to functional HSC with multilineage, long-term engraftment potential in transplantation assays. This methodology enables correlation of phenotypic properties of clonal hemogenic precursors with their functional engraftment potential or other properties such as transcriptional profile, providing a means for the detailed analysis of HSC precursor development at the single cell level.

Here we present methodology for the clonal analysis of hematopoietic stem cell precursors during murine embryonic development. We combine index sorting of single cells from the embryonic aorta-gonad-mesonephros region with endothelial cell co-culture and transplantation to characterize the phenotypic properties and engraftment potential of single hematopoietic precursors.

並べ替え内皮細胞ニッチ共培養と組み合わせて 1 つのセル インデックスを使用して胚性造血幹細胞前駆体のクローン解析

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

発生生物学

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood cytopenias, dysplasia, and a propensity for transformation to acute leukemia. NUP98-HOXD13 (NHD13) transgenic mice recapitulate human MDS in terms of peripheral blood cytopenias, dysplasia, and transformation to acute leukemia. We previously demonstrated that MDS could be transferred from a genetically engineered mouse with MDS to wild-type recipients by transplanting MDS bone marrow nucleated cells (BMNC). To more clearly understand the MDS cell of origin, we have developed approaches to transplant specific, immunophenotypically defined hematopoietic subsets. In this article, we describe the process of isolating and transplanting specific populations of hematopoietic stem and progenitor cells. Following transplantation, we describe approaches to assess the efficiency of transplantation and persistence of the donor MDS cells.

We describe the use of hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) to assess the malignant potential of genetically engineered hematopoietic cells. HSCT is useful for evaluating various malignant hematopoietic cells in vivo as well as generating a large cohort of mice with myelodysplastic syndromes (MDS) or leukemia to evaluate novel therapies.

骨髄異形成症候群の起源を評価するために造血幹細胞移植の使用

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

Engineering Oncogenic Heterozygous Gain-of-Function Mutations in Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Throughout their lifetime, hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) acquire somatic mutations. Some of these mutations alter HSPC functional properties such as proliferation and differentiation, thereby promoting the development of hematologic malignancies. Efficient and precise genetic manipulation of HSPCs is required to model, characterize, and better understand the functional consequences of recurrent somatic mutations. Mutations can have a deleterious effect on a gene and result in loss-of-function (LOF) or, in stark contrast, may enhance function or even lead to novel characteristics of a particular gene, termed gain-of-function (GOF). In contrast to LOF mutations, GOF mutations almost exclusively occur in a heterozygous fashion. Current genome-editing protocols do not allow for the selective targeting of individual alleles, hampering the ability to model heterozygous GOF mutations. Here, we provide a detailed protocol on how to engineer heterozygous GOF hotspot mutations in human HSPCs by combining CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair and recombinant AAV6 technology for efficient DNA donor template transfer. Importantly, this strategy makes use of a dual fluorescent reporter system to allow for the tracking and purification of successfully heterozygously edited HSPCs. This strategy can be employed to precisely investigate how GOF mutations affect HSPC function and their progression toward hematological malignancies.

Novel strategies to faithfully model somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) are necessary to better study hematopoietic stem cell biology and hematological malignancies. Here, a protocol to model heterozygous gain-of-function mutations in HSPCs by combining the use of CRISPR/Cas9 and dual rAAV donor transduction is described.

ヒト造血幹細胞および前駆細胞における発癌性ヘテロ接合性機能獲得変異の改変

Throughout their lifetime, hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) acquire somatic mutations. Some of these mutations alter HSPC functional ...

Evaluation of Abnormal Growth-related Genes of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells by Combining CRISPR/Cas9 Technology with Cell Counting

Hematopoietic stem cells possess the ability for long-term self-renewal and the potential to differentiate into various types of mature blood cells. However, the accumulation of cancerous mutations in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) can block normal differentiation, induce aberrant proliferation, and ultimately lead to leukemogenesis. To identify and/or evaluate the cancerous mutations, we integrated CRISPR/Cas9 technology with the Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay to investigate a model gene Trp53, that is essential for abnormal proliferative ability of HSPCs. Specifically, bone marrow cells enriched for HSPCs from Cas9 mice were harvested and then subjected to viral transfection with single-guide RNAs (sgRNAs) targeting one or several candidate genes to introduce genetic alterations in HSPCs. Then, a CCK-8 assay was performed to investigate the proliferative capacity of transfected HSPCs. The sgRNA targeting efficiency was confirmed by a Tracking of Indels by Decomposition assay. These identified genes may play crucial roles in leukemogenesis and could serve as potential therapeutic targets.

Here, we present a protocol that integrates CRISPR/Cas9 technology with the Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay to identify candidate genes that are crucial for the abnormal proliferative capacity of hematopoietic stem and progenitor cells.

CRISPR/Cas9技術とセルカウンティングの併用による造血幹細胞および前駆細胞の異常増殖関連遺伝子の評価

Hematopoietic stem cells possess the ability for long-term self-renewal and the potential to differentiate into various types of mature blood cells. ...

Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting from advances in genome editing technology and lentivirus-mediated transgene delivery systems, an efficient and economical method is described here that establishes mice in which genes are manipulated specifically in hematopoietic stem cells. Lentiviruses are used to transduce Cas9-expressing lineage-negative bone marrow cells with a guide RNA (gRNA) targeting specific genes and a red fluorescence reporter gene (RFP), then these cells are transplanted into lethally-irradiated C57BL/6 mice. Mice transplanted with lentivirus expressing non-targeting gRNA are used as controls. Engraftment of transduced hematopoietic stem cells are evaluated by flow cytometric analysis of RFP-positive leukocytes of peripheral blood. Using this method, ~90% transduction of myeloid cells and ~70% of lymphoid cells at 4 weeks after transplantation can be achieved. Genomic DNA is isolated from RFP-positive blood cells, and portions of the targeted site DNA are amplified by PCR to validate the genome editing. This protocol provides a high-throughput evaluation of hematopoiesis-regulatory genes and can be extended to a variety of mouse disease models with hematopoietic cell involvement.

Described are protocols for the highly efficient genome editing of murine hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) by the CRISPR/Cas9 system to rapidly develop mouse model systems with hematopoietic system-specific gene modifications.

疾患モデルにおける血化細胞の研究のためのレンチウイルスCRISPR/Cas9媒介ゲノム編集

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting ...

免疫・感染学

Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). Mutations in driver genes, that confer cellular fitness, can lead to the development of expanding HSPC clones that increasingly give rise to progeny leukocytes harboring the somatic mutation. Because clonal hematopoiesis has been associated with heart disease, stroke, and mortality, the development of experimental systems that model these processes is key to understanding the mechanisms that underly this new risk factor. Bone marrow transplantation procedures involving myeloablative conditioning in mice, such as total-body irradiation (TBI), are commonly employed to study the role of immune cells in cardiovascular diseases. However, simultaneous damage to the bone marrow niche and other sites of interest, such as the heart and brain, is unavoidable with these procedures. Thus, our lab has developed two alternative methods to minimize or avoid possible side effects caused by TBI: 1) bone marrow transplantation with irradiation shielding and 2) adoptive BMT to non-conditioned mice. In shielded organs, the local environment is preserved allowing for the analysis of clonal hematopoiesis while the function of resident immune cells is unperturbed. In contrast, the adoptive BMT to non-conditioned mice has the additional advantage that both the local environments of the organs and the hematopoietic niche are preserved. Here, we compare three different hematopoietic cell reconstitution approaches and discuss their strengths and limitations for studies of clonal hematopoiesis in cardiovascular disease.

We describe three methods of bone marrow transplantation (BMT): BMT with total-body irradiation, BMT with shielded irradiation, and BMT method with no pre-conditioning (adoptive BMT) for the study of clonal hematopoiesis in mouse models.

クローン造造を研究するマウスにおける骨髄移植手順

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production of all mature blood cells. In recent years cellular metabolism has emerged as a crucial regulator of HSC function and fate. We have previously demonstrated that modulation of mitochondrial metabolism influences HSC fate. Specifically, by chemically uncoupling the electron transport chain we were able to maintain HSC function in culture conditions that normally induce rapid differentiation. However, limiting HSC numbers often precludes the use of standard assays to measure HSC metabolism and therefore predict their function. Here, we report a simple flow cytometry assay that allows reliable measurement of mitochondrial membrane potential and mitochondrial mass in scarce cells such as HSCs. We discuss the isolation of HSCs from mouse bone marrow and measurement of mitochondrial mass and membrane potential post ex vivo culture. As an example, we show the modulation of these parameters in HSCs via treatment with a metabolic modulator. Moreover, we extend the application of this methodology on human peripheral blood-derived T cells and human tumor infiltrating lymphocytes (TILs), showing dramatic differences in their mitochondrial profiles, possibly reflecting different T cell functionality. We believe this assay can be employed in screenings to identify modulators of mitochondrial metabolism in various cell types in different contexts.

Here we describe a reliable method to measure mitochondrial mass and membrane potential in ex vivo cultured hematopoietic stem cells and T cells.

造血幹細胞とT細胞におけるミトコンドリア質量と膜電位の測定

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

生物学

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

Self-renewing&#160;multipotent&#160;hematopoietic stem cells (HSCs) are an important cell type due to their abilities to support hematopoiesis throughout life and reconstitute the entire blood system following transplantation. HSCs are used clinically in stem cell transplantation therapies, which represent curative treatment for a range of blood diseases. There is substantial interest in both understanding the mechanisms that regulate HSC activity and hematopoiesis, and developing new HSC-based therapies. However, the stable culture and expansion of HSCs ex vivo has been a major barrier in studying these stem cells in a tractable ex vivo system. We recently developed a polyvinyl alcohol-based culture system that can support the long-term and large-scale expansion of transplantable mouse HSCs and methods to genetically edit them. This protocol describes methods to culture and genetically manipulate mouse HSCs via electroporation and lentiviral transduction. This protocol is expected to be useful to a wide range of experimental hematologists interested in HSC biology and hematopoiesis.

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

Presented here is a protocol to initiate, maintain, and analyze mouse hematopoietic stem cell cultures using ex vivo polyvinyl alcohol-based expansion, as well as methods to genetically manipulate them by lentiviral transduction and electroporation.

エクスビボ ポリビニルアルコール培養におけるマウス造血幹細胞の増殖と遺伝子操作

Self-renewing&#160;multipotent&#160;hematopoietic stem cells (HSCs) are an important cell type due to their abilities to support hematopoiesis throughout ...

競争力の移植は、造血幹細胞のフィットネスを評価します

要約

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骨髄増殖性腫瘍の形質導入 - 移植マウスモデル

競争力のあるマウス骨髄移植モデルにおけるドナー細胞の生着を決定するために、定量的リアルタイムPCRを用いて

並べ替え内皮細胞ニッチ共培養と組み合わせて 1 つのセルインデックスを使用して胚性造血幹細胞前駆体のクローン解析

骨髄異形成症候群の起源を評価するために造血幹細胞移植の使用

ヒト造血幹細胞および前駆細胞における発癌性ヘテロ接合性機能獲得変異の改変

CRISPR/Cas9技術とセルカウンティングの併用による造血幹細胞および前駆細胞の異常増殖関連遺伝子の評価

疾患モデルにおける血化細胞の研究のためのレンチウイルスCRISPR/Cas9媒介ゲノム編集

クローン造造を研究するマウスにおける骨髄移植手順

造血幹細胞とT細胞におけるミトコンドリア質量と膜電位の測定

エクスビボポリビニルアルコール培養におけるマウス造血幹細胞の増殖と遺伝子操作

競争力の移植は、造血幹細胞のフィットネスを評価します

要約

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競争力のあるマウス骨髄移植モデルにおけるドナー細胞の生着を​​決定するために、定量的リアルタイムPCRを用いて

並べ替え内皮細胞ニッチ共培養と組み合わせて 1 つのセル インデックスを使用して胚性造血幹細胞前駆体のクローン解析

骨髄異形成症候群の起源を評価するために造血幹細胞移植の使用

ヒト造血幹細胞および前駆細胞における発癌性ヘテロ接合性機能獲得変異の改変

CRISPR/Cas9技術とセルカウンティングの併用による造血幹細胞および前駆細胞の異常増殖関連遺伝子の評価

疾患モデルにおける血化細胞の研究のためのレンチウイルスCRISPR/Cas9媒介ゲノム編集

クローン造造を研究するマウスにおける骨髄移植手順

造血幹細胞とT細胞におけるミトコンドリア質量と膜電位の測定

エクスビボ ポリビニルアルコール培養におけるマウス造血幹細胞の増殖と遺伝子操作

競争力のあるマウス骨髄移植モデルにおけるドナー細胞の生着を決定するために、定量的リアルタイムPCRを用いて

並べ替え内皮細胞ニッチ共培養と組み合わせて 1 つのセルインデックスを使用して胚性造血幹細胞前駆体のクローン解析

エクスビボポリビニルアルコール培養におけるマウス造血幹細胞の増殖と遺伝子操作