この新しい骨髄移植プロトコルは、宿主樹状細胞が移植後の移植片対宿主および移植片対白血病応答をどのように調節するかを調べるのに使用することができる。Ex vivo細胞再生は、このプロトコルを単に培養条件を変更することによってマクロファージおよび好中球のような他の免疫細胞集団の役割をテストするために適応することを可能にする。私と一緒に手順を実証することは、ラボマネージャーのクリスタル・ホサックと学部生のサンジーブ・グルシャニーです。
ドナーT細胞枯渇C57BL/6骨髄製剤の場合、安楽死させたドナーマウスから標準プロトコルに従って大腿骨および脛骨を収穫し、1%RPMI培地を含む直径92ミリメートルのペトリ皿に骨を移す。はさみを使用して、各骨から端を取り出し、新鮮な1%RPMI培地で26ゲージ針を装備した3ミリリットルのシリンジを充填します。針を1つの骨の一端に挿入し、プランジャーを押して骨髄を空洞から洗い流し、採取細胞ストレーナーに入れられます。
骨髄のすべてが収集されたら、骨髄片を75マイクロメートルのメッシュフィルターでひずみ、単一細胞懸濁液を新しい50ミリリットルチューブに移します。遠心分離によって細胞を沈め、0.5%BSAを補充したPBS中の1ミリリットル当たり6細胞に20倍10倍のペレットを再懸濁する。次に、摂氏4度で30分間インキュベーションするために、6つの細胞に10回10回0.05マイクログラムのTHI1抗体を加えます。
インキュベーションの終わりに、氷冷PBSの10ミリリットルで細胞を2回洗浄し、ペレットを1ミリリットル当たり7細胞に2倍10回再懸濁し、0.5%BSAに10%若いウサギ補体と2%のDNAsを37°Cで45分間培養します。インキュベーションの終わりに、1回の洗浄につき新鮮なPBSの15ミリリットルで細胞を2回洗浄し、0.5%BSAを含むPBSの20ミリリットルでペレットを再懸濁します。リンパ節と脾臓を40マイクロメートルの細孔ストレーナーにプールし、注射器プランジャーを使用してフィルターを介して組織を浸食して細胞を放出する。
1%FBSを補充したRPMI培地でストレーナーとプランジャーを洗浄し、遠心分離によって細胞を全て採取し、細胞を沈めます。細胞ペレットにACKライシスバッファーを5ミリリットル加えます。室温で5分後、1%FBSを添加した培地5ミリリットルで反応を停止し、遠心分離によって白血球をペレットにする。
カウント用に5ミリリットルのMACSバッファーでペレットを再懸濁し、新鮮なMACSバッファーで1ミリリットル当たり8個の細胞に2倍の濃度10の濃度に細胞を希釈します。抗赤芽球、抗顆粒球、抗B細胞、抗NK細胞の抗体を10回10回加え、摂氏4度で15分間のインキュベーションを行います。インキュベーションの終わりに、10ミリリットルの氷冷MACSバッファーで細胞を洗浄し、新鮮なMACSバッファーで1ミリリットル濃度当たり8細胞に10倍の10でペレットを再懸濁します。
次に、抗ビオチンマイクロビーズを10回10回0.22マイクロリットルを加え、摂氏4度で15分間インキュベーションを混合します。インキュベーションの最後に、10ミリリットルの氷冷MACSバッファーで細胞を洗浄し、標準的なビーズ分離プロトコルに従ってMACSxpressセパレータを使用して磁気ビーズ分離によって結合されていない濃縮T細胞を収集します。分離の終わりに、遠心分離によってT細胞を沈下し、カウント用に新鮮なMACSバッファーの5ミリリットルでペレットを再懸濁する。
骨髄由来樹状細胞を生成するには、野生型または因子Bノックアウトマウスの大腿骨から骨髄を分離し、ACKライシス緩衝液の5ミリリットルで赤血球を分解し、5分後に1%FBSで補ったRPMIの10ミリリットルで反応を停止する。遠心分離によって全血球を採取した後、ペレットを10ミリリットルの培養培地で10ミリリットルから1ミリリットル当たり6番目の細胞の2倍に再懸濁し、GM-CSFの1ミリリットル当たり20ナノグラムを細胞に加えて、10ミリリットルの細胞を37°C×15ミリメートルのペトリ皿に37°C、5%の二酸化炭素で6%の炭素で37度で個々の100ミリのペトリ皿に播種する。6日目に、プレートあたりLPSのミリリットル当たり25マイクログラムで骨髄由来樹状細胞培養を活性化する。
培養した骨髄細胞の少なくとも85%が樹状細胞に分化する。磁気ビーズ濃縮後のT細胞純度は90%であり、主要なMHC不一致C57BL/6 BALB/cモデルは、移植後のGVHDの発達に密接に対応しています。重症度のピークは、細胞転移の約11日後に起こり、その後、16日目までの臨床スコアおよび体重回復の減少が続く。
レシピエントは移植後30〜40日までにGVHDに均一に屈した。興味深いことに、因子Bノックアウト樹状細胞による移植は、レシピエント生存率およびGVHD臨床スコアを改善する。ルシファーゼ導入A20 B細胞リンパ腫は、生きている動物の腫瘍増殖のモニタリングを可能にする。
本代表的な実験では、骨髄単独とA20を受けた野生型BALB/cレシピエントのすべてが腫瘍再発で死亡した。骨髄由来ACC1枯渇ドナーT細胞を移植した野生型BALB/cレシピエントはGVHDで死亡した。さらに、ドナー骨髄およびACC1枯渇T細胞を受けた動物は、GVHDおよび腫瘍再発の両方で死亡した。
十分な骨髄細胞を生成するには、骨髄の補正前に、採取した脛骨および大腿骨に筋肉組織が完全に含まれていなければなりません。ビオチラーゼ抗CD3および抗ビオチンマイクロビーズを用いた骨髄細胞の陰性精製も、骨髄からリンパ球を枯渇させるために行われる。
