この方法は、悪性腫瘍を開始する細胞の特性評価に関する悪性腫瘍分野のいくつかの質問に答える助けとなる。この技術の主な利点は、これらの癌幹細胞の機能解析の基礎を提供することです。この技術の意味は、疾患を起こす細胞の同定に役立つため、骨髄異形成症候群またはMDSの治療のどこにまで及ぶ。
養子移送のためにレシピエントを準備するために、移植の1週間前に、特定の病原体のない動物施設で7日間、シプロフロキサシン1リットル当たり100ミリグラムを補充した無菌水を提供する。7日目には、訓練を受けた認定セシウム17オペレーターがセシウム源機器を1分間に70センチグレイの総体ガンマ照射を提供するように設定しました。カスタム設計のホルダーに10匹のマウスを入れる。
ホルダーを照射器室に挿入し、13分間で9つのグレーの全体照射を行う。その後、彼らのケージに動物を返します。翌朝、2〜6匹の蛾の古いC57ブラック6マウス全体に70%のエタノールをスプレーし、はさみを使用して骨盤から足首に皮膚を取り除きます。
はさみと一緒に鉗子を使用して、フェムラと脛骨を取り除く。骨から筋肉をきれいに整えます。脛門の近位と遠位の端をカットし、鉗子で1脛目を拾います。
27本のギゲ針を装着した3ミリリットルの注射器を骨髄腔に挿入し、2%の牛胎児血清またはHF2を補ったハンクス緩衝生理食塩水2.5ミリリットルを含む14ミリリットルの丸底管に骨髄を洗い流します。すべての骨髄が採取されたら、20ゲージ針先端を通して組織を数回吸引し、骨髄塊をカウント用の単一の懸濁液に分散させる。骨髄有核細胞、またはBMNCにフローソーティングのために標識するには、遠心分離によって細胞を収集し、HF2濃度の90マイクロリットル当たり10〜7BMNCでペレットを再懸濁する。
次に、ビオチン化された抗系統抗体カクテルの10マイクロリットルをセルサスペンションに加え、摂氏4度で20分間インキュベーションします。その後、3ミリリットルのPBSで遠心分離機洗浄を行う。ペレットを10倍の10倍の7細胞に100マイクロリットルのHF2で再懸濁する。
2マイクロリットルのAPCコンジュゲート型抗ビオチン抗体で細胞を二次標識する。光から保護された摂氏4度で20ミヌエット後、新鮮なPBSの3ミリリットルで細胞を洗浄する。氷上のヨウ化プロピジウム1ミリリットル当たり0.2マイクログラムを添加したHF2のペレットを再懸濁します。
未染色細胞を使用してフローサイトメトリー細胞選別機をキャリブレーションし、各検出器の線形範囲内ですべての光増倍管、散乱、蛍光パラメータを最適化します。非標識、PI標識および抗系系APC標識細胞に対して10,000個の細胞の3つのサンプルを取得する。並べ替えの最後に、各サンプルから1,000個の細胞を分析し、ソートされた細胞の純度と生存率を確認します。
遠心分離機のサンプルをスピンダウンします。その後、カウント用のHF2の0.5ミリリットルでペレットを再中断します。選別された細胞の養子移動のために、滅菌HF2のコンジェニックレシピエント動物から5番目の野生型BMNCに2倍の100マイクロリットルを混合する。
2〜5倍の10〜4番目の100マイクロリットルの100マイクロリットルで、レシピエント動物1匹あたりのマイクロ遠心分離管中の無菌HF2に関心のある選別ドナーBMNC。1ミリリットルのシリンジを1つロードし、200マイクロリットルの細胞を持つレシピエントあたり28ゲージを装備する。次いで、受信側マウスをヒートランプの下に置き、尾静脈拡張を誘導する。
尾静脈を介して各致死的に照射されたレシピエント動物に細胞混合物を送達する。幹細胞の自己再生は、陰性の野生型BMNCに限定されるため、系統陰性、低系統陽性、および高系統陽性細胞を選別し、野生型レシピエントに移植し、各細胞集団の自己再生能力を決定する。MDSモデル動物から移植された移植性ドナートランス遺伝子BMNCは、それらのCD45.2細胞表面マーカー発現によってex vivoを区別することができる。
トランスジェニックMDSドナー動物からの血統陰性BNMC、または未分類のBMNCの移植後16週間後までに、トランスジェニック細胞は、CD45.2陽性ドナー細胞の増加割合によって証明されるように野生型細胞を競い合い、致死的に照射されたレシピエント動物の末梢血において観察した。ここでトランスジェニックMDS細胞を移植したマウスから白血病の形質転換から細胞が示されている。多数の爆風と未熟な形の存在に注意してください。
手順を試みる間、それは細胞に過度のストレスを与え、細胞死または機能的損失をもたらす可能性があるため、ex vivo操作の時間を制限することを覚えておくことが重要です。開発後、この技術は、遺伝子組み換えマウスの病気の原因を探求するために悪性腫瘍を入れるためのフィールドプログラムの研究者のための道を開きます。
