このプロトコルは、卵巣組織の細菌を発見し、その機能を予測するように設計されています。免疫組織化学染色および16S rRNAシーケンシングは、その際の癌性および非癌性卵巣組織における細菌を発見および区別するために使用された。細菌の報酬と機能的な違いは、観察されていない日の再建によるコミュニティのBoPおよび細胞遺伝学的調査を用いて予測される。
私たちのプロトコルは、その現場で卵巣組織から細菌を抽出することを目的としています。また、あらゆる種類の腫瘍の細菌を発見するために使用することができます。私たちのプロトコルの主な利点は、それが簡単で便利であり、ほぼすべてのラボで実現できることです。
また、結果を得るのも迅速です。プロトコルの練習中に、 オフサイト腫瘍組織の細菌を除外することが重要です。したがって、このプロトコルのすべての手順は無菌である必要があります。
手術中、卵巣を約1センチメートルの厚さの組織サンプルに分けて、新しい滅菌ピンセットを使用した。手順全体の間に他の何かに触れないようにしてください。分離後、サンプルを無菌チューブに取り出し、液体窒素に入れて送出します。
サンプルをマイナス80°Cで保存します。ホルマリンで組織を固定し、パラフィンで埋め込みます。このプロトコルはここで一時停止することができます。
組織は、より長い保存のために室温に保つことができます。さらに手順を実行するために、サンプルを5マイクロメートルシリアルセクションに切ります。その後、サンプルを乾燥させます。
サンプルに対して、パラフィン脱水を行います。抗原を取り出すためには、EDTAバッファーでの10分間のマイクロ波処理が必要です。0.3%の水素を含むPBSにサンプルを浸します。
内因性ペルオキシダーゼ活性を停止するために20分間パーオキシド化する。LPSコアで抗体EMAを、1以上300の濃度で行う。そして、摂氏4度で一晩それを維持します。
細菌を発見するために、DAP基質キットを用い、HRPの存在を検出する。メーカーの指示に基づいて、HRPポリマー、抗ウサギ抗体を使用してください。テーブルコンセントレータを使用して、抗体を完全に組み合わせます。
PBSを使用して、結合されていない抗体を排除します。メーカーの指示に従って化学染色を行い、サンプルを水中に流します。サンプルに脱水を行います。
署名によるスーツのサンプル。そして、メーカーのプロトコルに基づいてイメージングプロプラス準備ライブラリを使用してサンプルとして入力します。遺伝子特異的配列とイルミナアダプターのオーバーハングヌクレオチド配列からなるプライマーパターンを練習する。
rRNA遺伝子配列上の細菌16sのV4領域の出生率を増幅するために、アンプリコンPCRを用いて入力されたDNAサンプルから鋳型を増幅する。Mag-Bind RxNPure Plus 磁気ビーズを使用して、PCR産物から反応ミックスを除去します。インデックス付き PCR 増幅を 2 度目に実行します。
ライブラリをチェックするには、Agilent 2200 TapeStationを使用します。量子フルーター dsDNA システムを使用して、ライブラリを定量化します。600サイクルのv3標準フローセルは、約100,000個のペアエンドを生成します。
2回300ベース3。ライブラリは非正規化され、プールされ、順序付けられます。すべてのサンプルの生のレートは、Trimmomaticによるシーケンシング品質に基づいてフィルトレートされます。
プライマーとアダプターのシーケンスは両方とも削除する必要があります。ペアと 25 未満の品質の両方を持つシーケンス読み取りは短縮する必要があります。ソフトウェアパッケージQIIMEで16s rRNAを分析します。
類似性カットオフが 97% の OTUS を形成する配列を集める OTUs の場合、各サンプルで相対的な量を計算する必要があります。すべてのシーケンスを並べ替える RDP トレーニング セットに含まれるベイジアン分類子を使用します。OTU を指定すると、シーケンスの主要な一貫性を持つ分類が OTUs に割り当てられます。
OTUs は、サンプル グループ情報に基づいて、Silva データベースに配置されます。アルファ多様性と UniFrac ベースの主座標系の解析を実行します。細菌の特性の関連のプレゼンテーションを予測するには、BugBaseを使用します。
PICRUStでのメタゲノムの機能組成を予測します。モニタリングデータと参照ゲノムを含むデータベースを用いて、STAMPソフトウェアの助けを借りて、各グループ間の異なる機能を分析します。1 つの統計ソフトウェアを使用して結果を計算します。
統計的有意性の指標は、pを0.05未満に設定する必要があります。学生のt検定で、年齢とパリティを含む交点因子を計算します。Chi-square検定により更年期状態、高血圧および糖尿病の歴史を計算します。
マン・ホイットニーU検定で卵巣細菌分類法の数を計算します。16人の患者がこの研究に登録された。BugBaseは、予測されたメタゲノムの分析を実践するために使用されました。
抗菌LPS抗体を用いた卵巣の病原性および免疫体化学の可能性この図は、がんおよび対照群における細菌の豊かさと多様性を示しています。16S rRNAシーケンシングによって明らかにされる。
この数字は観測種指数である。Chao1指数、ACE指数、シャノン指数、偶数指数、シンプソン指数それぞれ。この図では、フィラの相対的な存在量と、卵巣サンプル中の12種の最も豊富な細菌種が示されている。
図A、B、CおよびD.は、対照群および卵巣癌群における患者の卵巣におけるパネルの相対的な存在量を意味する。対照患者および卵巣癌群の卵巣における12種の最も豊富な細菌種の相対的な存在量。これは最も一般的です, PCoAとアノキシナトロナムシビリカムとメサノサルシナバクオレータの相対的な豊富を使用してクラスター化.
図 A は、PCoA を使用してクラスタ化された一般的な一般的な値を示しています。PC1 と PC2 は x 軸と y 軸にプロットされます。赤いブロックは卵巣癌群のサンプルと等しい。
青い円は、対照群のサンプルと等しくなります。卵巣癌群からのサンプルは、対照群の他のサンプルから分離することができる。図Bは、PCoAを使用してクラスタ化された一般的な一般的な値を示しています。
PC1 と PC2 は、x 軸と y 軸にプロットされます。赤いブロックは卵巣癌群のサンプルと等しい。青い固体円は、子宮筋腫を有する患者からのサンプルに等しい。
そして、青い中空円は、子宮内筋症の患者のサンプルに等しい。図Cは、アノキシナトロナムシビリカムの相対的な存在量を示す。図Dはメサノサルシナ・バクオラタである。
この図は、予測されたメタゲノミクスのBugBase分析です。癌群における卵巣の潜在的に病因的および酸化的ストレス耐性表現型は、対照群のそれよりも強かった。この図は、PICRUSt分析による癌と対照群の間のKEGG経路空間が有意に異なる。
我々は我々のサンプルを取得するとき、新しい滅菌ピンセットのペアが必要です。サンプルへの潜在的な汚染に注意してください。その細菌のオフサイト腫瘍組織は、解決に大きな影響を与える可能性があります。
制御グループをすべてのステップに設定することが好ましい。潜在的な汚染の影響を減らすために。
