異なる卵管セグメントは、別個の生理学的機能を有し、病理学的変化に対して異なる感受性を有する。非常に小さなマウス卵管における異なるセグメントの同定は、組織解離による良好な収率の産生と同様に困難である。このビデオでは、マウスの卵管のコイルを解き、異なるセグメントを認識して個別に分析できるようにする方法、そして最後に、分化解離した細胞の比較的高い収率を生成する方法を示します。
アンプラに特有の環境をよりよく理解することは、体外受精技術を改善するかもしれない。また、眼底を他のセグメントと対比させることで、眼底内科の悪性変換の傾向をよりよく理解できるかもしれない。単一細胞解離手順は、卵管から間質および上皮細胞を解放する。
私たちの方法はまた、卵管の生理学および病理学に対する免疫、平滑筋、および上皮細胞の寄与を別々に分析する機会を提供する。解剖顕微鏡下での作業は、最初は難しい場合があります。私はあなたのツールが卵管微小解剖に適切であることを確認するために子宮のようなより大きなチューブで練習することをお勧めします。
まず、歯用ワックスをペトリ皿に接着剤で貼り付け、乾かします。その後、70%エタノールで皿を消毒する。これで、表面は解剖の準備が整いました。
解剖の準備ができたら、解剖顕微鏡下で冷たいプラットフォーム上に歯科用ワックスを含むペトリ皿を固定化する。動物の腹側表面を70%エタノールで消毒する。その後、腹腔と骨盤腔を滅菌解剖ハサミで開きます。
胃腸管を片側に移動して、背側双角子宮を見つけます。腎臓のすぐ下の子宮脂肪パッドに包まれている各卵管と卵巣を見つけるために、各子宮角を吻側にたどります。次に、卵巣と遠位子宮角の一部がまだ取り付けられた側方卵管の両方を解剖ハサミを使用して切除します。
各側方子宮角を、コイル状の卵管と卵巣にまだ取り付けられたままの角の約1〜2センチメートルで切断する。組織を直ちに2ミリリットルの冷間解剖培地に沈め、次いで滅菌された25ゲージ針で子宮組織を歯科用ワックスに貼り付け、解剖のために組織を固定する。卵巣脂肪パッドと結合組織をきれいにして解剖し、卵管をはっきりと視覚化します。
1ミリリットルのシリンジを使用して、滅菌1%トルイジンブルー色素溶液を1〜2滴分注し、30秒〜1分間インキュベートする。冷たいDPBSですすぎ、すべての液体を取り除きます。コイル状の卵管から卵巣を軽く引き抜きます。
広い靭帯の滑液包膜で切断し、卵管組織を損なうことなく卵巣を卵管から除去する。子宮管接合部の側方に見られる卵管の遠位フィンブリアル端を見つける。チューブを静かに引っ張り、スプリングフォームのマイクロハサミでメソサルピンクスを切り取り、卵管を巻き戻します。
チューブを切断して眼底領域を作製する。次に、ターン2と3の間をカットしてアンプラリー領域を切除します。最後に、残りの部分を地峡領域である子宮管接合部に切断する。
解剖した組織セグメントを液体窒素で直ちにスナップ凍結し、次いで200マイクロリットルの冷RNA抽出試薬および1対1のホモジナイズビーズミックスをRNA単離のために組織に加える。フィンブリアル領域から始めて、スプリングフォームハサミでチューブを縦方向にスリットし、鉗子をてこにして管腔上皮を露出させます。スリットの開いた部分と残りの卵管を約1〜2ミリメートルのセグメントに細かく刻む。
次いで、5ミリリットルの温かい非酵素解離緩衝液を組織に加え、摂氏37度でインキュベートする。オクルージン、核、およびアセチル化チューブリンに対して陽性の細胞クラスターの蛍光および位相差画像をここに示す。赤はオクルジン、青は核、緑はアセチル化チューブリンを示します。
繊毛様根尖境界は、プロトコル全体を通して無傷のままであり、単一細胞へのさらなる消化に耐える。これらの代表的な画像では、マージされた、赤、青、位相コントラスト、および緑のチャンネルが示されている。短いプロナーゼインキュベーションの後、細胞の大部分は単一である。
ヨウ化プロピジウム染色は、明視野、赤色チャネルPI陽性、およびマージにおいて約93%の生存率を示す。マージ時の差し込み図は、単一の解離したセル上の無傷の繊毛境界を示す。そのような細胞は積極的に繊毛を叩いている。
全RNAについて、マイクロボリューム分光光度計およびバイオアナライザーによって収率および品質について評価した。結果は、この方法が、下流アッセイのための適切な収量のために2匹の動物からのプーリングが必要な場合がある眼底サンプルを除いて、セグメント当たり800〜1,200ナノグラムのRNAを生じることを示している。infundibulumについて提示された結果は、2匹の動物からプールされ、合計4つの眼底領域である。
このプロトコルは、マイクロボリューム分光光度計とバイオアナライザーで分析された純粋なRNAを首尾よく達成します。サンプルは、純粋なRNAヌクレオチド種の典型である1.8〜2の間の260×280ナノメートルの吸収比を有する。サンプルのバイオアナリシスは、7個を超える評価済みRNAインテグリティ数で高いRNAインテグリティを示し、下流の発現およびシーケンシング解析に適している。
卵管系を解剖プラットフォームに貼り付けるために、子宮角の1〜2センチメートルを保持することを忘れないでください。さらに、トルイジンブルー染料の使用は、卵管の迅速な巻き戻しに役立ちます。アンコイリングが速いほど、保存性が向上し、RNA分解の量が最小限に抑えられます。
この方法は、個々のセグメントシーケンシングを可能にするRNAシーケンシングに適切な品質のRNAを得るのに十分である。細胞解離は、単一細胞シーケンシングまたはフローサイトメトリーに適しており、より正確なセグメントおよび細胞分析を可能にします。この方法は、セグメントレベルまたは単一細胞レベルでの違いを隠すチューブ全体分析を超えてフィールドを移動するのに役立ちます。
