このプロトコルは、マイクロデバイスで制御可能な2Dおよび3D共培養を実行して、腫瘍免疫細胞のクロストークを視覚化および監視し、抗がん治療の効果を分析するための実験設定を提供します。この技術は、免疫細胞の動員と相互作用をリアルタイムで簡単に視覚化し、ヒトおよび患者由来のサンプルに使用できます。ほとんどの最先端の顕微鏡と互換性があります。
手順を実演するのは、サニータ・スペリオーレ・ディ・サニータ腫瘍学分子医学科の博士課程の学生であるフランチェスコ・ノートーと、トランスレーショナルメディシンおよび外科のカトリック大学サクロクオーレ大学の博士課程の学生であるニコレタ・マンドゥカとエスター・マカフェオです。チップは、クリーンルーム内のプラズマクリーナーまたは反応性鉄エッチング装置でプラズマ活性化されます。マウス脾臓細胞および腫瘍細胞株は、本文に記載されているプロトコルを模倣するためにここで使用されます。
細胞懸濁液をロードする前に、6つのリザーバーすべてから培地を取り出してください。次に、10〜50マイクロリットルの増殖培地に再懸濁した5番目の腫瘍細胞に1 x 10を左上のリザーバーと下部ウェルにゆっくりとロードします。右側で、50マイクロリットルの増殖培地に再懸濁した6番目の浮遊免疫細胞に1 x 10を2つのウェルに静かにピペットで入れます。
すべての細胞を添加したら、各チップの6つのリザーバーすべてを最大100〜150マイクロリットルの増殖培地で満たし、細胞が各培養コンパートメント内に正しく分布していることを確認します。チップを1時間インキュベートして、タイムラプス記録の前にシステムを安定させます。生細胞イメージングの場合は、顕微鏡ステージのチッププレートに腫瘍免疫を取り付けます。
Incucyte生細胞解析ソフトウェアなどの顕微鏡ソフトウェアインターフェイスで取得ワークフロー設定をカスタマイズします。観察ウィンドウ、最適なフレームレート、および期間を、実験および研究中の細胞タイプの適切なパラメータに応じて選択します。適切な実験期間の細胞を画像化する。
コールドチップを使用して、2つの実験条件のために薬物または薬物の組み合わせを含む培地で希釈したマトリゲルの2つのアリコートを調製します。氷上のマトリックス溶液に懸濁したライブ適合性の蛍光色素染色腫瘍細胞を穏やかにピペットでピペットし、細胞の均一な分布を得ました。チッププレートを冷却ブロックまたは氷の入ったバスケットに置いた状態で、冷たい10マイクロリットルのマイクロピペットチップを使用して、薬物処理された腫瘍細胞マトリックス溶液を左右のゲルポートにゆっくりと注入します。
穏やかな圧力を加えて、マトリックス溶液をチャネルの一方の側からもう一方の側に押します。すべての腫瘍細胞がロードされたら、装置を直立位置のインキュベーターに30分間置きます。インキュベーションの最後に、マトリックスのゲル化が完了したら、6つのリザーバーすべての培地チャネルを50マイクロリットルの培地で満たします。
重合ゲルの完全性と腫瘍細胞の分布を顕微鏡で確認します。次に、免疫細胞の準備が完了するまでチップをインキュベーターに入れます。インキュベーション後、各ウェルから培地を吸引する。
先端を中央培地チャネルの入口の近くに置き、適度な圧力を使用して、対照的な蛍光色素で標識された6番目の免疫細胞に10個の10マイクロリットルを静かに注入します。50〜100マイクロリットルの培地を横方向チャネルの4つのウェルのそれぞれに注入し、40〜90マイクロリットルの培地を上部中央ウェルに、および50〜100マイクロリットルの培地を下部中央ウェルに注入する。すべてのウェルがロードされたら、顕微鏡を使用して、免疫細胞の分布が中央チャンバーに限定されたままであることを確認します。
次に、イメージングするまで、細胞培養インキュベーター内の平らな面にデバイスを慎重に置きます。腫瘍区画に浸潤する蛍光染色された生免疫細胞の程度を計算するには、蛍光顕微鏡によって特定の時間関心のあるポイントでデバイスをイメージングし、Nikon NIS-Elementsなどの顕微鏡イメージングソフトウェアで適切なカメラパラメーターを設定します。標識された免疫細胞のパラメータも設定します。
マイクロ流体プラットフォーム内に適切に構築されたマイクロチャネルブリッジを通って標的細胞に向かう白血球の動きは、ビデオ顕微鏡によって追跡することができる。この追跡分析では、個々のPBMCは、死にかけているドキソルビシン処理または生きたPBS処理された癌細胞に挑戦しました。関連する走化性値と遊走プロットが自動的に生成され、ドキソルビシンまたはPBSに曝露された乳がん細胞と同時負荷した場合、免疫細胞の異なる遊走プロファイルが観察されました。
PBMCがアポトーシス癌細胞に直面したとき、それらは死にかけている細胞と死んだ細胞に向かってマイクロチャネルを通過しましたが、生きている未処理の細胞には交差しませんでした。24〜48時間にわたって密度が増加した白血球の一部は、ドキソ処理された癌細胞との長期接触を示した。この分析では、新しい3D免疫適格腫瘍モデルを使用して、エピジェネティック薬の抗がん剤の組み合わせに応答する免疫細胞の動員を定量化しました。
次に、赤色染料標識PBMCを中央の流体チャンバーに均一に分配しました。次に、2つの腫瘍塊がPBMCを引き付ける能力を比較し、この実験でPBMCを右側のマイクロチャネルに堅牢に採用しました。3Dモデルの場合、溶液をヒドロゲルとセルを氷上で混合し、気泡や予備重合を避けます。
過度の圧力をかけずにゆっくりと注入します。使用するマトリックスに応じて重合ステップを調整します。生細胞/死細胞アッセイおよび上清からのサイトカイン分泌プロファイリングを実施できます。
共焦点イメージングのための免疫蛍光は、免疫サブタイプを分類し、活性化および枯渇成熟の発現マーカーのために行うことができる。
