新血管新血管の発生は、正常および病理学的事象の両方において高度に調節されたプロセスである。新血管新生をよりよく理解するためには、自然細胞微小環境の中でプロセスを再構築することが重要です。マイクロ流体チップと自動制御を開発しました。
非常に効率的な循環は、灌流マイクロチューブを形成し、新しい血管化の最初のイベントに再現するためにタンパク質を使用するようにシミュレートするために行われます。マイクロ流体発芽チップは3つのチャネルで構成されていました。内皮細胞培養チャネルと液体チャネルを広い中央ヒドロゲルチャネルで分離した。
マイクロ流体制御システムは、マイクロシリンジポンプと電磁ピンチバルブで構成されていました。バブルトラップチップ、マイクロ流体発芽チップ、マイクロ蠕動ポンプ、および培地貯留部。マイクロ流体システムでは、内皮細胞は高い発光せん断応力、経経皮流の生理学的レベル、および様々な血管内皮成長因子分布によって同時に刺激され得る。
ピペット20マイクロリットルのフィブロネクチン1ミリリットル当たり125マイクログラムを細胞培養チャネルの1つの培地注入口に入る。細胞培養チャネルのポートにハサミを合わせるようにピペットチップを切ります。ピペットチップを細胞培養チャネルの他の培地注入口に挿入します。
次いで、細胞培養チャネルから空気を出してピペットをフィブロネクチンで満たす。チップを摂氏37度で1時間インキュベートします。細胞播種前に、各培地注入口に20マイクロリットルの内皮細胞培地をピペットし、30分間摂氏37度でチップをインキュベートする。
次に、すべてのメディアインジェクションポート内のすべてのメディアをピペットアウトします。次に、5マイクロリットルの細胞懸濁液を、細胞培養チャネルの1つの培地注入口にピペットする。その後、内皮細胞は、差動静圧下でチャネル全体に急速に広がった。
他のポートに約4〜6マイクロリットルのECM培地を加え、静水圧を調整し、セルの移動を停止します。チップを細胞インキュベーターにリモートします。その後、2時間後に内皮細胞が細胞培養チャネルの内部表面の周りにコートするまで、30分ごとにチップをひっくり返す。
ピペットチップを使用して、注入ポートに取り付けられたセルを非常に慎重に取り除きます。次に、4 つの有刺鉄線の女性 Luer アダプターをメディアインジェクション ポートに挿入し、ECM メディアで埋めます。チップをセルインキュベーターに取り出し、ECMメディアとLuerアダプタを12時間ごとに交換します。
マイクロ流体制御システムを組み立てるには、2つのポリテトラフルオロエチレンチューブ、2つの短いシリコンチューブ、3つの長いシリコンチューブ、1つの有刺鉄線の女性ルアーアダプター、1つのYタイプコネクタ、そして3つのLタイプコネクタを準備します。シリンジに予熱ECM培地10ミリリットルを充填します。ポリテトラフルオロエチレンチューブを有刺鉄ブされた女性ルアーアダプターで注射器に接続します。
次に、ポリテトラフルオロエチレンチューブの他端をY型コネクタに接続します。次に、2本の長いシリコンチューブをY型コネクタの他の両端に接続します。1本のチューブを使用してリザーバに接続し、もう1つのチューブを使用してバブルトラップチップに接続します。
別の長いシリコンチューブをリザーバに接続します。次に、バブルトラップチップの最上層上の全ての入口と出口穴を接続するために2つの短いシリコンチューブを使用します。ポリテトラフルオロエチレンチューブをチップのバックエンドに接続します。
次に、注射器をマイクロシリンジポンプに固定します。2本の長いシリコンチューブを電磁ピンチバルブにクリップします。次に、電磁ピンチバルブを切り替えて、シリンジとリザーバの間のパイプラインを開きます。
マイクロシリンジポンプを使用して、チューブ内の空気を排気するために、リザーバに媒体を注入します。次に、再度バルブを切り替えて、シリンジとバブルトラップチップの間でパイプラインを開きます。液体チャンバーとバブルトラップチップのバックエンドチューブを充填するためにメディアを注入します。
細胞インキュベーターから内皮発芽チップを取り出し、次に細胞培養側のルアーアダプターを取り除きます。マイクロ流体発芽チップのハイドロゲル注入口に2つのパイププラグを挿入します。バブルトラップチップのバックエンドチューブを細胞培養チャネルの1つのポートに接続します。
T型コネクタを他のポートに挿入し、リザーバに接続された長いシリコンチューブに接続します。長いシリコンチューブをマイクロペリスタチックポンプにクリップします。次に、エアフィルターを貯留槽に挿入します。
次に、マイクロ流体発芽チップをステージ上のインキュベーターに組み立てます。次に、TPUチューブでバブルトラップチップの底層の穴に真空ポンプを接続します。マイクロシリンジポンプと電磁ピンチバルブを同時に制御するカスタムプログラムで、反対の循環量と流量を設定します。
次に、マイクロ蠕動ポンプの流量を設定する。マイクロシリンジポンプをオンにします。そして、循環制御システムが確立される。
40kDa F-I-T-Cデキストリンの拡散透過係数を測定することで、モデル内の一部のマイクロ血管のバリア機能をテストします。図に示すように、細胞内層を有するスタティック培養チップの拡散透過係数は、毎秒0.1プラスマイナス0.3マイクロメートルである。そして、細胞内層のない空流路の拡散透過係数は、毎秒5.4プラスマイナス0.7マイクロメートルである。
内皮発芽アッセイは、内皮細胞が主に24時間の静的培養後に中央ヒドロゲルに芽を出し、発芽度は、発光せん断応力の増加に伴って有意に減少することを示した。また、発芽の面積、平均芽芽長、最長の芽長の点から、内皮芽の発芽が有意に減少した。我々のシステムでは、内皮細胞のせん断応力は、経内皮流が生理学的レベルにとどまっている間、実験中にいつでも任意に変化することができる。
このin vitro 3Dバイオミメティックモデルは、ネオア眼ラライゼーション機構の研究に直接適用することができ、薬物スクリーニングおよび毒物学アプリケーションのための低コストプラットフォームとしての潜在的な約束を保持しています。
