このプロトコルは、多能性幹細胞からのヒト血管オルガノイドの生成の概要を示しています。この技術は、血管新生、血管新生、血管疾患、ならびに血管病理学の側面を研究するために使用することができる。再現性とハイスループットの性質、および多くの異なる幹細胞株にわたる一貫性は、この技術の強力な利点です。
それらの応用に関して、私たちの以前の研究のいくつかは、糖尿病患者の血管系の形態学的変化を研究するための血管オルガノイドの使用を概説し、糖尿病性血管障害の薬物治療の道を探っています。初期幹細胞集団を適切に維持し、凝集体の凝集を防ぎ、ほぼ均質な凝集体直径を確保することは、良好な血管オルガノイドを生成するために不可欠な要素です。70%のコンフルエント性を有する培養ヒト多能性幹細胞(hPSC)を用いて凝集体の生成を開始します。
ピペットまたは真空システムを使用して、培養液を吸引し、1ミリリットルの細胞解離試薬と交換してから、細胞を摂氏37度で5分間インキュベートします。一方、テキスト原稿に記載されている処方に従って、15ミリリットルの円錐管で必要量の凝集培地を準備します。細胞をインキュベートした後、細胞解離試薬を吸引してから、細胞を1ミリリットルの凝集培地に懸濁します。
内容物を静かに上下にピペットで移動して、単一細胞懸濁液を作成します。自動細胞計数装置または顕微鏡下で細胞を計数し、凝集体形成に必要な細胞の総数を計算します。細胞生存率の読み出しは、クラスターが少ないかまったくない単一細胞懸濁液を示しています。
チューブから上清を吸引し、15ミリリットルの高透明度ポリプロピレンコニカルチューブ内の凝集培地に適切な量の細胞懸濁液を加え、希釈した細胞懸濁液を上下に静かにピペットで移動して、均一な細胞分布を確保します。3ミリリットルの希釈細胞懸濁液を6ウェル超低付着培養プレートの各所望のウェルにピペットで入れる。プレートをインキュベーターに入れ、骨材のサイズと形状を維持するために外乱を最小限に抑えます。
テキスト原稿に記載されているように中胚葉培地を準備します。細胞の播種後24時間で、培養プレートをインキュベーターから取り出す。プレートを円を描くように旋回させて、各ウェルの中央に凝集体を蓄積します。
1ミリリットルのピペットを使用して、培地を含む凝集体を各ウェルから対応する円錐管に静かに移します。骨材を円錐管内に室温で1時間沈降させます。沈降したら、沈殿した凝集体を乱すことなく、ピペットまたは高感度吸引ポンプで上清を慎重に吸引します。
2ミリリットルの中胚葉誘導培地を添加して、各チューブ内の凝集体を再懸濁する。次に、懸濁液を各チューブから超低付着6ウェル培養プレートのそれぞれのウェルに戻します。プレートを摂氏37度のインキュベーターに入れ、4日目まで放置します。
4日目に、培養プレートをインキュベーターから取り出し、プレートを円を描くように振って、各ウェルの中央にある凝集体を回収します。1ミリリットルのピペットを使用して、凝集体を周囲の培地とともに各ウェルから対応する円錐管に静かに移します。タイマーを30分に設定して、骨材がチューブ内に沈殿できるようにします。
凝集体が沈降したら、前述のように培養プレートを準備し、6日目まで摂氏37度のインキュベーターに入れます。凝集体の埋め込みと血管スプラウト誘導のために、氷上で作業しながら、細胞外マトリックス溶液の所望の最終容量を準備します。500マイクロリットルのECMを12ウェルプレートの1つのウェルにピペットで入れ、ECMサンドイッチの第1層を形成する。
最初のECM層の効果的な重合を確実にするために、プレートを摂氏37度のインキュベーターに2時間置きます。2時間のインキュベーションの終わりに向かって、培養プレート内の凝集体の操作を開始します。1ミリリットルのピペットを使用して、各ウェルの凝集体と培地を各ウェルの対応する15ミリリットルの円錐管に静かに移す前に、各ウェルの中央に凝集体を集めます。
上清を吸引する前に、凝集体を10〜15分間沈降させます。その後、骨材を含む円錐形のチューブを氷の上に5分間保ちます。迅速かつ慎重に作業し、気泡が形成されることなく500マイクロリットルのECMに凝集体を再懸濁します。
ピペットを使用して、12ウェルプレートのウェル内のウェル内のすでに重合された最初のECM層の上にECM凝集懸濁液を層状にします。それまでの間、テキスト原稿に記載されているように発芽培地を準備します。摂氏37度で2時間インキュベートした後、摂氏37度に予熱した発芽培地1ミリリットルをウェルに加え、血管分化を誘導します。
無菌条件下で作業する場合は、滅菌スパチュラの丸みを帯びた端を使用して、血管網を含むECM発芽マトリックスを緩めます。次に、滅菌鉗子と滅菌ヘラの丸みを帯びた端を使用して、緩めたゲルディスクを10センチメートルの培養皿の蓋に慎重に移します。所望の倍率および焦点に調整された実体顕微鏡下で蓋の上にゲルを置き、そして滅菌針を使用して単一の血管網を切り取り、その過程で得られる血管新生されていないECMの量を制限しようとする。
単離したオルガノイドを、3ミリリットルの発芽培地を含む超低アタッチメント6ウェルプレートの1ウェルに静かに戻します。次に、1ミリリットルのピペットを使用して、単一のオルガノイドを超低アタッチメント96ウェルプレート内の適切な数のウェルに移します。移管したら、200マイクロリットルの予熱した発芽培地を96ウェルプレートの各ウェルに加えます。
96ウェルプレートでの単離後4〜6日で、オルガノイドの固定と染色に進む前に、オルガノイドが丸くて健康な形態を持っていることを確認してください。hPSCからのヒト血管オルガノイド(hBVO)生成の段階的な進行の画像を明視野下で撮影した。0日目に、hPSC培養から直径30〜100ミクロンの範囲の凝集体が生成された。
凝集体の大きさと形状の微妙な変化は、1日目の中胚葉誘導時に観察され、4日目に凝集体が血管プライミングを受けるにつれてさらに変化しました。ほぼ放射対称の初期の血管発芽は、凝集体を発芽マトリックスに埋め込んだ翌日の7日目に観察できます。9日目に健康なオルガノイド形態と継続的な血管発芽が見られ、オルガノイド中心の密な細胞構造がほとんど消失する10日目までに後期血管発芽に進行した。
成熟ヒト血管オルガノイドに典型的な形態は、15日目までに明確に観察された。15日目の成熟hBVOの全マウント染色は、CD31陽性であり、PDGFR-β陽性寄生虫およびSMA陽性α平滑筋アクチンに囲まれた広範囲で接続された内皮ネットワークを示しました。内皮血管網を封入したPDGFRβ陽性およびSMA陽性の壁画細胞はよく観察される。
血管網を包む連続的なコラーゲンIV陽性基底膜も観察された。包埋ステップ中に細胞外マトリックスの適切な重合を確実にすることは、効果的な血管発芽にとって重要です。研究者は、当社の血管オルガノイド技術を使用して、以前は貪欲であった脳や腎臓などのすでに確立されたオルガノイドモデルで初期の血管コンパートメントを生成しました。
