L'obiettivo generale di questa procedura è separare le cellule follicolari e gli ovociti nel follicolo ovarico di Zebrafish. Il follicolare è l'unità di base dell'ovaio, che consiste degli ovociti e delle cellule follicolari circostanti. È l'ampio strumento per separare sia la cellula follicolare che i compartimenti esterni per politiche ben ricercate tra cui la cattura primaria delle cellule follicolari e l'aumento dell'espressione genica, tutta la saturazione e la fecondazione in vitro.
Recentemente, zebrafish è diventato un potente modello di Nissan, che studia un controllo dello sviluppo già. Qui, presentiamo un metodo semplice, quindi separa le cellule follicolari e gli ovociti del follicolo Zebrafish che faciliterà le indagini sullo sviluppo già in Zebrafish Lo spot, nessuna massa o i due separati sulle cellule follicolari e su tutti i lati dei giri utilizzano post che ha un labirinto, richiede tempo e ha avuto alti danni all'esterno. Qui, abbiamo stabilito un metodo semplice per due scomparti separati usando o in parte gli occhiali tasso Tamela sotto una barriera corallina pura.
Il nostro mirino Metro, sia all'esterno che alle cellule follicolari, può essere facilmente fabbricato digitando il capillare in vetro tirato. In primo luogo, preparare un capillare di vetro poeta. Colpire la testa del capillare di vetro sul bruciatore di alcol.
Utilizzare quattro lati per allungare il capillare di vetro al diametro della carta rave. In secondo luogo, desect che sovrascriva dal pesce femmina adulto, isola i follicoli ovarico dall'ovaio. Infine utilizzare un capillare di vetro pollato per separare la cellula follicolare e l'ovocita dai follicoli ovarici.
Preparare il capillare in vetro, il contenitore affilato, l'ampia fresa, il bruciatore di alcol e una flesso. Mentire il bruciatore di alcol, portare a casa un bicchiere di capillare e riscaldare un'estremità del vetro capillare sul fuoco del bruciatore di alcol. Utilizzare una forza per tenere un'altra estremità del capillare di vetro, stressare il capillare di vetro in modo rapido e delicato.
Metti i rifiuti di vetro nel contenitore affilato. Utilizzare l'ampia fresa Gretch sulla piscina con vetro. Quindi rompere con le forcep Delicatamente per fare un'apertura liscia dello sguardo della porta bruciare rapidamente l'estremità del capillare di vetro sul bruciatore di alcol più volte e strofinare l'estremità aperta con un'ampia fresa con attenzione.
Prendi come il acquario del sistema idrico coltivato. E ora lega le femmine adulte posizionando i pesci sull'acqua ghiacciata per almeno due o cinque minuti fino a quando i pesci non fermano il movimento gill. Estraere il pesce dalla ghiacciaia e rimuovere il corpo rimanente del pesce d'acqua con l'asciugamano, posizionare un pesce sul piatto di sezione D con quattro set.
I pesci sono stati decapitati servendo l'accordo di Spang usando le loro forbici affilate per garantire la morte. Utilizzare le forbici sezionanti per tagliare come segue. Sezionare dalla Chloe tagliata alle branchie lungo la linea mediana dell'addome, tagliata dalla riva della Chloe, tagliata dalla punta anteriore al lato dorsale.
Rimuovere delicatamente la pelle e i muscoli su un lato del corpo, esporre gli organi interni e prendere un'ovaia intera sana con quattro passaggi. Le ovaie sono state posizionate delicatamente immediatamente nei 100 millimetri di coltura, contenitore per piatti 60%L 50 mediana. Inviato un microscopio sezionante con ottica luminosa trasmessa in base alle dimensioni e alla morfologia dei follicoli ovariani di diversi stadi.
Isolare manualmente questi follicoli ovarico usando una birra in lizza per quattro set. Raccogliere i follicoli ovarici isolati e metterli in un altro piatto coltivato contenente 60%L 50 medio, bei follicoli ovarici isolati saranno utilizzati per separare le cellule follicolari e gli ovociti. Quindi impostare un dispositivo per la separazione.
Utilizzare un tubo di plastica di 30 centimetri. Un'estremità è collegata con una punta di pipetta millilitro con un elemento filtrante. Un'altra estremità è collegata con una punta della pipetta da 200 microliter.
Al microscopio disectante, utilizzare la bocca per controllare il flusso d'aria per lasciare che il difettoso si muova in piscina con capillare di vetro, quindi soffiare la follia esce dal capillare di vetro. Durante questo processo, la cellula follicolare e gli ovociti dei follicoli ovarici possono essere separati. Questo è un processo di separazione per un follicolo da stadio maturo.
Durante il processo di inalazione, lo strato cellulare follicolare viene staccato dall'Ovocita, fa dopo aver soffiato la cellula follicolare e l'ovocita può essere separato. Questo è un follicolo a fasi a terra completo. Possiamo vedere che lo strato cellulare follicolare è staccato dall'Ovocita.
Questo metodo può essere applicato anche nei follicoli ovarico nella fase iniziale. Questo è un follicolo nella fase centrale di Latella Genesis. Questo è un follicolo all'inizio della fase della Genesi vatella.
Questo è un follicolo in una fase pre-vatalla Genesis. Da questa immagine, puoi vedere il processo di separazione. Il primo pannello mostra un follicolo intatto nel pannello del palco adulto.
Il secondo pannello mostra l'angolazione di questo follicolo nel capillare di vetro tirato. Il pannello tre mostra che il follicolare è stato soffiato fuori dal capillare di vetro tirato. Il quarto pannello indica la separazione riuscita F denudato ovocita e cellula follicolare.
Anche questo metodo, la separazione della cellula follicolare negli ovocite può essere eseguita in follicoli a diversi stadio. Esaminare se le cellule follicolari sono state separate dai follicoli intatti. Intatto un follicolo ed è separato Ovocita da diversi stadi di follicoli dallo stadio BV allo stadio FG sono stati macchiati con DAPI.
Il nucleo delle cellule follicolari può essere macchiato da DAPI. Il segnale blu del DAPI è stato osservato nei follicoli intatti ma non gli ovociti denudati in questi diversi follicoli dello stadio. Per confermare ulteriormente la netta separazione, i follicoli intatti e gli ovociti separati stavano esorbiando le sezioni istologiche.
Dapi che ha indicato i risultati ha mostrato che le cellule follicolari sono state chiaramente rimosse e denudato gli ovociti. Usando questo metodo, gli ovociti denudati separati dai follicoli a stadio adulto sono stati trovati sottoposti alla maturazione spontanea degli ovociti. senza alcun trattamento dopo quattro ore di incubazione.
Dopo l'attivazione con acqua, questi ovociti maturi possono subire la piena espansione del chorion. Questo risultato indica il basso danno all'ovocita utilizzando questo metodo. Pertanto, questa senape può essere utilizzata per ottenere l'ovocita denudato per lo studio della razione maturata di ovocita del pesce Zebra.
Lo strato follicolare del materiale ai follicoli può essere rimosso da un tubo di vetro capillare. Questi possono essere fecondati e devoluti nella fase di schiusa. I risultati suggeriscono che questo metodo può essere utilizzato per la fecondazione in vitro nei pesci Zebra.
Descriviamo qui un nuovo metodo per la rapida e facile separazione delle cellule follicolari e degli ovocite dai follicoli ovarici di pesce zebra. Questo metodo presenta diversi vantaggi significativi, metodologie rovesciate. Il principale di questi è aumentare notevolmente la facilità di separazione in quanto è necessaria una sola manipolazione esterna.
La maggiore facilità di separazione aumenta la disponibilità di questo metodo per i ricercatori non qualificati nella microdisezione. In secondo luogo, questo metodo può essere utilizzato per separare la cellula follicolare e l'ovocita dei follicoli ovarici e delle prime fasi di sviluppo, incluso lo stadio PV, EBV MV, tale separazione non può essere eseguita nel follicolo in fase iniziale utilizzando le metodologie attuali. In terzo luogo, questo nuovo metodo porta a meno danni agli ovociti.
Gli ovociti denudati separati da questo metodo possono subire la maturazione degli ovociti e possono essere fecondati. Inoltre, questo metodo può essere applicato anche in altri pesci.
