O objetivo geral deste procedimento é separar células foliculares e Oócitos no folicular ovariano do zebrafish. O folicular é a unidade básica do ovário, que consiste nos Oócitos e nas células foliculares circundantes. É a ampla ferramenta para separar tanto a célula folicular quanto os compartimentos externos para políticas de bem-pesquisa, incluindo a captura primária de células foliculares e aumentos na expressão genética, toda saturação e fertilização in vitro.
Recentemente, o Zebrafish tornou-se um modelo poderoso da Nissan, que estuda um controle do já desenvolvimento. Aqui, apresentamos um método simples, assim separa células foliculares e oócitos de zebrafish folicular que facilitará investigações do já desenvolvimento em Zebrafish O comercial, sem massa ou os dois se separa sobre células foliculares e todos os lados dos giros estão usando post que tem um labirinto, demorado e teve alto dano ao exterior. Aqui, estabelecemos um método simples para dois compartimentos separados usando ou parte óculos taxa Tamela sob um recife puro.
Nosso escopo metro, tanto fora quanto as células foliculares podem ser facilmente fabricados digitando o capilar de vidro puxado. Primeiro, prepare um poeta capilar de vidro. Bata na cabeça do capilar de vidro no queimador de álcool.
Use um quatro lados para esticar o capilar de vidro até o diâmetro do cartão rave. Em segundo lugar, o desect que se sobrepõe aos peixes fêmeas adultas, isolam os folículos ovarianos do ovário. Finalmente use um capilar de vidro pesquisado para separar células foliculares e Oócito dos folículos ovarianos.
Prepare o recipiente capilar de vidro, recipiente afiado, cortador amplo, queimador de álcool e um fórceps. Deite o queimador de álcool, leve para casa um copo de capilar e aqueça uma extremidade do capilar de vidro no fogo do queimador de álcool. Use um fórceps para segurar outra extremidade do capilar de vidro, estresse o capilar de vidro de forma rápida e suave.
Coloque o resíduo de vidro no recipiente sharps. Use o cortador amplo Gretch na piscina com vidro. Em seguida, rompa-se pelos fórceps Suavemente para fazer uma abertura suave do olhar do porto queimar rapidamente a extremidade do capilar de vidro no queimador de álcool várias vezes e esfregar a extremidade aberta por um cortador amplo cuidadosamente.
Veja como o aquário do sistema de água cultivada. E agora as fêmeas adultas amarram peixes na água gelada por pelo menos dois a cinco minutos até que os peixes parem o movimento de Gill. Retire o peixe da caixa de gelo e remova o corpo restante do peixe-água por toalha, coloque um peixe na placa de seção D com quatro conjuntos.
Os peixes foram decapitados servindo acordes de Spang usando sua tesoura afiada para garantir a morte. Use a tesoura dissecando para cortar da seguinte forma. Disseco do corte chloe para as brânquias ao longo da linha média do abdômen, cortado do banco da Chloe, cortado da ponta anterior para o lado dorsal.
Remova suavemente a pele e os músculos de um lado do corpo, exponha os órgãos internos e tome ovário inteiro saudável com quatro passos. Os ovários foram colocados imediatamente nos 100 milímetros de cultura, recipiente de prato 60%L 50 mediana. Enviou um microscópio dissecando com óptica de luz transmitida com base no tamanho e morfologia dos folículos ovarianos de diferentes estágios.
Isole esses folículos ovarianos manualmente usando uma cerveja de quatro conjuntos. Recolher os folículos ovarianos isolados e colocá-los em outro prato cultivado contendo 60%L 50 folículos ovarianos isolados serão usados para separar células foliculares e Oócitos. Em seguida, defina um dispositivo para separação.
Use um tubo de plástico de 30 centímetros. Uma extremidade é conectada com uma ponta de pipeta de um mililitro com um elemento filtro. Outra extremidade está conectada com uma ponta de pipeta de 200 microliter.
Sob o microscópio de dissecting, use a boca para controlar o fluxo de ar para deixar os defeituosos se movendo para a piscina com capilar de vidro e, em seguida, soprar a loucura sai do capilar de vidro. Durante esse processo, células foliculares e oócitos de folículos ovarianos podem ser separados. Este é um processo de separação para um folículo de estágio maduro.
Durante o processo de inalação, a camada celular folicular é separada do Oócito, faz depois de soprar a célula folicular e o oócito pode ser separado. Este é um folículo de palco completo. Podemos ver que a camada celular folicular está separada do Oócito.
Este método também pode ser aplicado nos folículos ovarianos em estágio inicial. Este é um folículo no meio da fase Latella Genesis. Este é um folículo no estágio vatella genesis.
Este é um folículo em um estágio pré-vatalla Genesis. A partir desta foto, você pode ver o processo de separação. O painel um mostra um folículo intacto no painel de palco completo.
O painel dois mostra a angulação deste folículo em capilar de vidro puxado. O painel três mostra que o folicular foi explodido do capilar de vidro puxado. O painel quatro indica a separação bem sucedida F desnudado Oócito e célula folicular.
Mesmo este método, a separação da célula folicular em Oócito pode ser realizada em diferentes folículos de estágio. Investigue se as células foliculares foram separadas dos folículos intactos. Um folículo intacto e é separado Oócito de diferentes estágios de folículos do estágio BV para o estágio FG foram manchados com DAPI.
O núcleo das células foliculares pode ser manchado pelo DAPI. O sinal azul do DAPI foi observado em folículos intactos, mas não desnudados Oócitos nestes diferentes folículos estágio. Para confirmar ainda mais a separação clara, os folículos intactos e os Oócitos separados estavam estripando para as seções histológicas.
Os resultados da DAPI mostraram que as células foliculares foram claramente removidas e desnudadas oócitos. Usando este método, os oócitos desnudos separados dos folículos de estágio adulto foram encontrados para submeter-se à maturação espontânea do oócito. sem qualquer tratamento após quatro horas de incubação.
Após a ativação por água, esses Oócitos maduros podem passar pela expansão completa do acorde. Este resultado indica o baixo dano ao Oócito usando este método. Assim, esta mostarda pode ser usada para obter o Oócito desnudado para estudar a ração amadurecida oólito de peixe zebra.
A camada folicular do material aos folículos pode ser removida por um tubo de vidro capilar. Estes podem ser fertilizados e retornam para o estágio de eclosão. Os resultados sugerem que este método pode ser usado para fertilização in vitro em peixes zebra.
Descrevemos aqui um novo método para a rápida e fácil separação de células foliculares e Oócitos dos folículos ovarianos do peixe zebra. Este método tem várias vantagens significativas, metodologias derrubadas. Entre eles, o principal deles é aumentar muito a facilidade da separação, pois apenas uma única manipulação externa é necessária.
O aumento da facilidade de separação aumenta a disponibilidade desse método para aqueles pesquisadores não habilitados em microdisseção. Em segundo lugar, este método pode ser usado para separar células foliculares e Oócitos de folículos ovarianos e estágios de desenvolvimento precoce, incluindo pv, estágio EBV MV, tal separação não pode ser realizada em estágio inicial folículo usando metodologias atuais. Terceiro, este novo método leva a menos danos aos Oócitos.
Os Oócitos desnudos separados por este método podem sofrer a maturação do Oócito e podem ser fertilizados. Além disso, este método também pode ser aplicado em outros peixes.
