この方法は、異なる成長条件およびストレス状況の中で、グローバルレギュレータppGppのレベルを測定する。PpGppは、グラム陽性および陰性細菌、ならびに葉芽細胞で見つけることができます。PpGppは数秒で急速な発症を有し、ストレスが発生すると速い第2の関係につながる。
同時に、それは30秒まで短い半減期を持っています。したがって、ストレス遷移を含め、10秒から時間まで変化する可能性のある時間間隔で多くの培養を監視する必要があります。マイクロタイターディッシュの細菌培養物の放射ラベルも、複数の技術的および生物学的複製を可能にする高スループットサンプリングを容易にします。
放射性物質を扱う際には、適切な安全対策に従ってください。この手順を開始するには、テキスト プロトコルで説明されているとおりに、すべてのメディアを準備します。3ミリモルリン酸ナトリウムとMOPS培地で一晩培養を成長させます.
MOPS培地550マイクロリットルを加え、0.2マイクロモルリン酸ナトリウム担体と各細菌接種物の30マイクロリットルを24ウェルプレートの井戸に加えます。これにより、OD600が0.1の初期接種が発生します。1つだけでなく、滅菌制御に新鮮なメディアを追加します。
プレートを摂氏37度の振度インキュベーターに入れ、900 RPMで30分間振ります。同じ条件でインキュベートしながらプレートリーダーを使用して、p32を欠いている媒体で平行に複製プレートを有するプレートリーダーを用いて成長を監視することができる。次に、プレートの各ウェルにp32またはリン酸の100マイクロキュリーを加えます。
振度インキュベーターで培養物を1~2倍に成長させ、外部ラベルが細胞間ヌクレオチドプールと大部分が平衡化できるようにします。適切な視覚化のために、このビデオではアクティブな材料は使用されなかった。実際の実験では、適切なシールドが必要であり、測量メーターによる汚染を常に監視する必要があります。
まず、研究した一種のストレスに適した方法を用いてストレスを誘発する。次に、各標識された細胞サンプルの20マイクロリットルを別々の0.2ミリリットルPCRチューブに加え、20マイクロリットルの氷冷6モルギ酸を含む。すぐにサンプルをドライアイスの上に置きます。
凍結と解凍の3サイクルで細胞抽出効率を高めます。PEIセルロース薄層クロマトグラムを見つける直前に、ペレット細胞の破片に最大速度で1分間サンプルを遠心分離します。まず、20%20センチメートルのPEIセルロースTLCプレートをセットする。
はさみを使って上の5センチを取り除きます。そして、柔らかい鉛筆を使用して、端から1センチメートルの原点線をマークします。各サンプルの5マイクロリットルの液滴をPEI表面に塗布します。
スポットが乾燥する前に、元のサンプルスポットに触れないほど浅い1.5モルのリン酸モノカリウムの層を含むタンクにプレートを移します。気密シールでタンクを覆い、15センチメートルのトリミングシートの上部に液体の上昇を可能にします。その後、完全に開発したクロマトグラムを取り出し、室温で空気乾燥させます。
遊離P32を含むクロマトグラムの上部を放射性廃棄物に切り捨てて捨てます。蛍光体スクリーンを使用して、一晩の放射線フィルムを露出させます。翌日、フィルムを開発し、リンイメージャーを使用して蛍光体の緑色信号をキャプチャして定量します。
次に、ImageJ ソフトウェアを使用して放射性スポットを定量化します。ppGppの蓄積を可能にするのに十分な時間のストレスまたは飢餓を引き起こした後、適切な方法を使用して応力を逆にします。20 ~ 30 秒ごとに最大 2 分間サンプルを採取し、前述の手順でサンプルを処理します。
TLCが開発され、時間経過中にppGppのレベルが得られたら、残りのppGpp含有量を半対数プロット対時間でプロットします。本研究では、ILVを除くすべてのアミノ酸を含むMOPSで増殖した細胞をP32で標識した。ラベルが付くと、Lバリンが追加され、イソロイシン飢餓が生じる。
5分後、グアノシンのテトラおよび五リン酸のレベルの2と2.5の古い増加が起こった。細胞の自由標識サンプルの陰性制御は、P32ソースでオルソリン酸塩でない可能性のある化合物を検出するために使用されます。イソロイシン飢餓の逆転は、タンパク質合成の阻害剤であるクロラムフェニコールによって達成され、荷電イソロイシンtRNAの消費を減少させ、次に、荷電していないtRNAに対する高い比率を回復させる。
強力な再ラ媒介ppGpp合成酵素の活性化は廃止され、残留合成によって妨げられないppGpp分解の尺度を可能にする。この場合、ppGpp は約 64 秒の半減期で減衰します。ストレスや飢餓を誘発する前に、細胞が均一なラベリングを達成するために、何世代にもわたって細胞を成長させることが重要です。
ppGppは細菌間に広く普及しているため、この方法は他の生物にも応用できる。TLC開発方法の改変は、ppAppのようなすべての調節ヌクレオチドの適切な分離を可能にする可能性がある。P52は、より良いエミッタ同位体であるため、適切なシールドを使用し、任意の残留物を適切に廃棄することが重要です。
