このプロトコルにより、研究者は分析パイプラインを合理化できるだけでなく、オルガノイドストリームからより多くの情報を抽出できるため、翻訳の関連性が向上します。このプロトコルの主な利点は、合理化されたワークフローと自動化された臨床的に関連する分析パイプラインを組み合わせることで、研究者が1つのオルガノイドスクリーニングから説得力のある量の情報を取得できることです。この手法は、これらのex vivoオルガノイド薬物スクリーニングから癌患者の臨床治療反応を予測するために使用でき、非常に有望な初期結果が得られます。
目的は、ソフトウェアソリューションプラットフォームにとらわれないようにして、研究者が利用可能な生細胞イメージング機器を使用できるようにすることです。まず、6ウェルマイクロプレートの細胞外マトリックス(ECM)ドーム内の患者由来の腫瘍オルガノイド(PDTO)を酵素的に解離させます。このためには、最初に培地を吸引し、ECMドームをPBSで一度洗浄します。
次に、ウェルに2ミリリットルの解離酵素を加えます。1ミリリットルのピペットを使用して内容物を10回上下にピペットし、ドーム内のオルガノイドを機械的に解離してから、プレートを摂氏37度で10分間インキュベートします。インキュベーション後、内容物を上下にピペットで固定し、顕微鏡を使用してオルガノイドが単一細胞に適切に解離しているかどうかを確認します。
細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに集め、ADF+遠心チューブを室温で450gで5分間添加して10ミリリットルまで容量を作り、パスツールピペットと吸引ポンプを使用して上清を吸引します。ペレットのサイズに応じて、ペレットを100〜200マイクロリットルの全膵管腺癌(PDAC)のオルガノイド培養培地に再懸濁してから、選択した方法を使用して細胞数をカウントします。単一細胞をECMドームに播種するには、融解したECMを必要量加えて、適量の細胞懸濁液を希釈します。
次に、摂氏37度に予熱した6ウェルプレートに、ウェルあたり最大10個の20マイクロリットルの液滴をピペットで入れます。プレートを裏返し、摂氏37度で30分間インキュベートします。次に、10マイクロモルのY-27632を添加したフル培地でウェルをオーバーレイし、インキュベーター内で2〜3日間インキュベートします。
2〜3日齢のオルガノイドを回収するには、まず培地を吸引し、PBSでオルガノイドを1回洗浄します。次に、ECMドームの数に応じて、摂氏4度に予冷した1〜2ミリリットルのオルガノイド採取溶液を6ウェルプレートのウェルに加えます。氷上に保ったプレートを、振とう台上で10分間インキュベートします。
次に、ウェル内の内容物を1ミリリットルのピペットで上下にピペッティングして、ECMドームを解離します。もう一度、オルガノイドを氷上で10分間インキュベートしてから、顕微鏡でECMドームの解離を視覚的に確認します。0.1%BSAをPBSでプレコートした15ミリリットルのチューブにオルガノイドを回収し、ADF+遠心分離機を加えてチューブを200gで摂氏4度で5分間、10ミリリットルに増やします。
次に、上清を吸引し、そのサイズに応じてペレットを最大1ミリリットルのフルPDACオルガノイド培地に所望の最終オルガノイド濃度まで再懸濁する。ピペッティングロボット制御アプリケーションを開き、[プロトコル]を選択し、[インポート]をクリックしてから、提供された補足ファイル6を指定されたフィールドにドラッグアンドドロップします。インポートしたプロトコルを選択します。
また、[デッキのセットアップ]フィールドに示されているレイアウトに従って、冷却要素やプラスチック製品を含むすべての実験器具をデッキに配置します。左側のスロットは、25ミリリットルのリザーバーと冷却要素に使用します。次に、[プロトコルの実行]をクリックしてセットアップに進みます。
[ラボウェアのセットアップ]タブを開き、[ラボウェアの位置チェックを実行]をクリックして、指示に従ってピペッティングロボットを新しいハードウェアに合わせて校正します。冷却エレメントの上に置かれた25ミリリットルのリザーバーに冷却されたオルガノイド播種溶液を入れ、Start Run をクリックしてピペッティングロボットを作動させます。次に、マイクロプレートを100gの速度で摂氏4度で1分間遠心分離する。
デジタル薬剤ディスペンサー制御ソフトウェアを使用して薬剤調剤プロトコルを作成するには、プレートレイアウトの上にあるプレート1にカーソルを合わせます。[プレート属性の編集]を選択し、[流体]の横にある追加ボタンをクリックして、プレートタイプを384ウェル、追加容量を50マイクロリットル、DMSO制限を1%[流体の追加]に入力します。次に、DMSOベースまたは水性プラストゥイーン20としてクラスを選択し、濃度を入力します。
薬物滴定のプレートレイアウトを作成するには、[ウェル]を選択し、[滴定]をクリックします。液体の場合は、目的の薬物を、希望する最高濃度と最低濃度とともに選択します。反復の場合は、最低2つを選択し、目的の滴定パターンを選択します。
ポジティブコントロールのプレートレイアウトを作成するには、3つのウェルを選択し、[値の設定]をクリックして、DMSOの10ミリモルストックから2マイクロモルのスタウロスポリンを充填して、最大の細胞死を誘導します。Cytotox Greenの場合は、使用済みのウェルをすべて選択し、値の設定をクリックして、ウェルあたり60ナノモルの値を入力します。ネガティブコントロールとDMSO正規化では、車両コントロール用にさらに4つのウェルを含むすべてのウェルを選択します。
次に、正規化された流体クラスをDMSOベースとして割り当てる前に、右クリックして[正規化]を選択します。次いで、最高クラスの体積に正規化して、各ウェルにおいて等しいDMSO濃度を得る。次に、左上隅の[実行]の下の矢印をクリックし、[常にシミュレート]を選択してから、[シミュレート]をクリックしてエラーを特定し、準備する各薬剤の量を取得します。
次に、[実行]ボタンの下の[常にシミュレート]のチェックを外してから、[実行]をクリックして薬剤調剤プロトコルを開始し、指示に従います。シーリングメンブレンをマイクロプレートに適用して、蒸発を防ぎます。ライブセルイメージャー制御ソフトウェアを開き、メソッドエディターの新規を選択してから、ファイルに移動してサンプルメソッドXMLファイルをインポートします。
または、原稿の指示に従って新しいファイルを作成します。次に、[開始]をクリックしてスキャンを開始し T0.To データをマージおよび圧縮し、生細胞イメージャー制御ソフトウェアによって各時点で各スキャン用に生成されたすべての個別の実験フォルダーを転送するための新しい親フォルダーを作成し、原稿の指示に従ってそれぞれのフォルダーに名前を付けます。デジタル薬剤ディスペンサー制御ソフトウェアでXLSXプレートマップを準備するには、薬剤調剤プロトコルからプレートマップレイアウトを右クリックし、すべてのウェルをコピーしてXLSXファイルにデータを貼り付けます。
Cytotox Greenとスタウロスポリンのデータを削除し、細胞株のマトリックスを追加して、ネガティブコントロールとポジティブコントロールを入力します。データ圧縮ツールを開きます。[検索]をクリックし、親フォルダを選択し、[圧縮]をクリックして画像データの圧縮を開始します。
すべてのTIFF画像ファイルは、親フォルダー内の新しいデータセットフォルダー内のウェルごとに1つのHDF5に圧縮されます。画像を解析するには、画像解析 Web アプリ プラットフォームに移動してログインし、[ホーム] タブの [新しいプロジェクトの追加] をクリックします。プロジェクト名を入力し、[続行] を押して [新しい実験の追加] を選択してから、HDF5 ファイルを含むデータセット フォルダーをアップロードします。
アップロード後、プロジェクトと実験のフォルダーに移動し、[プレートマップのアップロード]をクリックして追加機能を確認します。次に、[分析の実行]を順番にクリックし、[マルチオルガノイド分析]、[デフォルトパラメーター]、[最後に分析]を選択して画像分析を開始します。[結果のダウンロード]をクリックして、各ウェルの測定値とセグメント化された画像またはビデオを含む生データテーブルをダウンロードしてから、さらなるデータ処理のために分析の精度を確認します。
オルガノイド播種密度とサイズの変動を説明するために、増殖速度ベースの測定基準を使用して、エラーバーの減少によって示されるように、反復間の変動を減らしました。ネガティブコントロール、ポジティブコントロール、およびゲムシタビンとパクリタキセルで治療されたPDTOの組み合わせの画像は、治療が主に限られた量の細胞死で成長停止を誘発し、正規化された薬物反応(NDR)値に対応することを示しました。PDAC_052とPDAC_087の2つの追加ラインを使用すると、3つのライン間で成長率に明確な違いが観察され、GRメトリックの使用がサポートされました。
NDR線量反応曲線は、GR曲線と比較して、3つの異なる患者間のダイナミックレンジと分離の増加をもたらしました。経時的なNDRの決定は、PDAC_052とPDAC_060が低用量のゲムシタビン-パクリタキセルに対して非常に類似した細胞増殖抑制薬物反応を示したが、対応する中用量および高用量で明確な細胞増殖抑制反応と細胞傷害反応の差が観察されることを示した。これらの薬物反応は、患者で観察された臨床反応と一致していました。.
クローン動態は、PDAC_087が治療後に最も耐性のあるサブクローンを有することを明らかにしたが、これは患者において観察された疾患の攻撃的な性質と一致しており、興味深いことに、陽性対照スタウロスポリンに対して最も感受性が低い。プロトコルの最も重要な側面は、ECMの誤った固化が下流の画像分析を妨げる可能性があるため、シード中にECMを含むすべての溶液を冷却し続けることです。ウェットラボ作業、画像分析、およびダウンストリームデータ処理の自動化は、研究を加速し、新しい併用療法をより簡単に特定するのに役立ちます。
