コットンボルワームは世界で最も破壊的な害虫の1つです。CRISPR/Cas9技術によるゲノム編集により、この生物の遺伝子機能や遺伝子間の相互作用をさらに研究することができます。この技術の2つの主な利点は、それが高い特異性を有し、遺伝可能であることである。
sgRNA標的を選択するには、CRISPRオンラインWebサイトにアクセスして、可能なガイドサイトと遺伝子の5つの主要な非翻訳領域に近いエクソンを検索します。テキストボックスにエクソン配列を入力し、ヘリコベルパ・アルミゲラの標的ゲノムを選択します。20 BPNGGのPAMオプションを選択し、ウェブサイトのユーザーマニュアルに従って、デフォルトのパラメータに他の設定を残します。
ソフトウェアから予測されたガイドシーケンスを比較し、予測効率が最も高く、ミスマッチが最も少ない5つのプライム非翻訳領域の近くに1つまたは2つのグアニンを含む20塩基対のガイドシーケンスを選択して、編集効率を向上させ、オフターゲット編集を削減します。胚調製のために、3日齢の男性と2日齢の女性から50人の健常者を選択し、それらをきれいなネットケージに混ぜる。10%砂糖溶液を含む湿った綿片をケージに入れます。
ネットケージをガーゼで覆い、ガーゼを輪ゴムで固定します。ガーゼに水をスプレーして湿らせます。黒い布を適切な大きさにカットし、湿ったガーゼをこの黒い布と交換して、30分間自由な卵子の位置を可能にします。
顕微鏡スライドに両面テープを貼り付けます。鉗子を使用して、両面テープの表面に卵の入ったパッチを一列に貼り付けます。各パッチの余白を押して、テープにしっかりとくっついていることを確認します。
顕微鏡スライドあたり50〜100個の卵を集める。マイクロインジェクションの前に、顕微鏡を氷の上にスライドさせて胚の発生を遅らせてください。本文原稿に記載されているようにマイクロピペットプーラーを用いてキャピラリーガラスを引っ張って針を準備する。
マイクログラインダーを使用して針先を鋭利な先端に研削します。PCRチューブ内のRNaceフリー水に市販のCas9タンパク質とsgRNAの2マイクロリットルを加えて注射液を調製し、10マイクロリットルの容量混合物を得た。ピペッティングでよく混ぜて氷の上に置きます。
電子マイクロインジェクタのパラメータを設定します。マイクロローダーピペットチップを使用して2マイクロリットルの混合物を針にロードし、ニードルの先端にできるだけ多くの残留空気を排出する。注射針をマイクロマニピュレーターに接続し、2つの部品をしっかりと接続します。
スライドをペトリ皿に置き、顕微鏡のステージに置きます。針先を胚の上半球に45度の角度で慎重に挿入する。ペダルを押して混合物を胚に送り込み、胚のわずかな膨張をもたらす。
胚からすぐに針を引っ込め、次の胚が針に接するまで片手でペトリ皿を動かします。十分な孵化量を確保するために、同じ手順を用いて少なくとも300個の胚を注入する。注射後にペトリ皿の蓋を覆う。
胚の表面色が暗くなったら、顕微鏡スライドの周りのペトリ皿に人工飼料を入れます。24穴培養プレートを用意し、各ウェルを体積容量の1/3まで人工飼料で満たします。小さなペイントブラシを使用して孵化幼虫を選び出し、1つの井戸に1つの幼虫が1匹いるように、それらを24ウェル培養プレートに移す。
幼虫が第3齢期に成長したら、それらを新しいガラス延性エトラエに移す。新しく封入されたG-zeroオス成虫と野生型雌成虫を、同じ比率で新鮮なネットケージに移す。綿球に落とした10%砂糖溶液を彼らに供給します。
G-oneの蛹化まで日常的な方法を用いて昆虫を後方にする。鉗子を使用して後肢を慎重に取り除き、各脚をライシングマトリックスチューブに入れます。組織ホモジナイザーを使用して後肢を均質化する。
ホモジナイズされた試料のゲノムDNAを、製造元の指示に従って市販のgDNA抽出キットを用いて抽出する。テキスト原稿からジェノタイピングプライマーおよびPCR反応条件を用いて遺伝子セグメントを増幅する。遺伝子シーケンシングサービスで遺伝子型を確認します。
同じ遺伝子型のG-one個体を1つのネットケージに入れ、G-one子孫を自己横断し、同じ方法を用いてスクリーニングを継続する。目的遺伝子の標的部位は、その第2エクソンに位置していた。この部位は高度に保存され、合成されたsgRNAの標的バンド断片をアガロースゲル電気泳動を用いて確認した。
単一のsgRNA標的の変異体検出は、G-one親ユニットからのPCR産物を配列決定することによって行った。異なるエクソン間で重複しないsgRNAペアを使用することの有効性は、変異体の大きな欠失が野生型パンと容易に区別されるため、実証された。一定数の変異個体を得た後、電気生理学的または行動学的実験を行い、異なる遺伝子間の遺伝子機能および相互作用を明らかにすることができる。
