O algodão bollworm é uma das pragas mais destrutivas do mundo. A edição de genomas com a tecnologia CRISPR/Cas9 permite mais pesquisas sobre a função genética e a interação entre diferentes genes neste organismo. As duas principais vantagens dessa técnica são que ela tem alta especificidade e é herediável.
Para escolher os alvos do sgRNA, acesse o site online do CRISPR para procurar possíveis sites-guia e os exons próximos às cinco principais regiões não traduzidas do gene. Insira a sequência de exon na caixa de texto e selecione o genoma alvo para a armigera Helicoverpa. Escolha a opção PAM para 20 BPNGG e deixe as outras configurações nos parâmetros padrão, de acordo com os manuais de usuário do site.
Compare as sequências de guia previstas do software e escolha uma sequência guia de 20 pares de base contendo um ou dois guaninos perto da região não traduzida cinco prime com a maior eficiência prevista e menos incompatibilidades para melhorar a eficiência de edição e reduzir a edição fora do alvo. Para a preparação de embriões, selecione 50 indivíduos saudáveis de machos de três dias de idade e fêmeas de dois dias de idade, e misture-os em uma gaiola limpa. Coloque um pedaço de algodão úmido contendo solução de 10% de açúcar na gaiola.
Cubra as gaiolas com gaze e conserte a gaze com um elástico. Borrife água na gaze para mantê-la úmida. Corte um pano preto em um tamanho apropriado e substitua a gaze úmida por este pano preto para permitir a posição de ovário livre por 30 minutos.
Cole fita dupla face em um slide de microscópio. Usando fórceps, cole as manchas com ovos em uma fileira na superfície da fita de dois lados. Pressione a margem de cada patch para ter certeza de que eles grudam firmemente na fita.
Colete de 50 a 100 ovos por deslizamento de microscópio. Antes da microinjeção, mantenha o microscópio deslizando no gelo para atrasar o desenvolvimento de embriões. Prepare a agulha puxando um vidro capilar usando um puxador de micro pipeta, como descrito no manuscrito do texto.
Triture a ponta da agulha usando um moedor micro até uma ponta afiada. Prepare soluções de injeção adicionando dois microliters de proteína Cas9 comercializada e sgRNA à água sem RNace em um tubo PCR para obter uma mistura de volume de 10 microliteres. Misture bem por pipetting e coloque-o no gelo.
Defina os parâmetros do microinjetor eletrônico. Coloque dois microliters da mistura em uma agulha usando uma ponta de pipeta de microcarregador, esgotando o máximo de ar residual na ponta da agulha possível. Conecte a agulha de injeção a um micromanípulo e garanta uma conexão apertada entre as duas partes.
Coloque um slide em uma placa de Petri e coloque-o no palco do microscópio. Insira cuidadosamente a ponta da agulha no hemisfério superior de um embrião em um ângulo de 45 graus. Pressione o pedal para entregar a mistura no embrião, levando a uma leve expansão do embrião.
Retire a agulha imediatamente do embrião e mova a placa de Petri com uma mão até que o próximo embrião esteja próximo da agulha. Injete pelo menos 300 embriões usando o mesmo procedimento para garantir uma quantidade suficiente de eclosão. Cubra a tampa das placas de Petri após a injeção.
Quando a cor superficial dos embriões escurecer, coloque dieta artificial na placa de Petri ao redor do slide do microscópio. Prepare placas de cultura de 24 poços e encha cada poço a 1/3 de sua capacidade volumétrica com dieta artificial. Escolha a larva de eclosão usando uma pequena escova de tinta e transfira-as para a placa de cultura de 24 poços, de tal forma que um poço tenha uma larva.
Quando a larva crescer para o terceiro estágio instar, transfira-as para uma nova ethrae de dúcteo de vidro. Transfira os recém-fechados adultos do sexo masculino G-zero e adultos do tipo selvagem para uma gaiola de rede fresca em uma proporção igual. Suprir-lhes com 10% de solução de açúcar descartada em bolas de algodão.
Insetos traseiros usando métodos de rotina até a pupação de G-1. Use fórceps para remover cuidadosamente uma perna traseira e coloque cada perna em um tubo da Matriz de Lysing. Homogeneize a perna traseira usando um homogeneizador de tecido.
Extrair o DNA genômico da amostra homogeneizada usando um kit comercial de extração de gDNA de acordo com as instruções do fabricante. Amplie o segmento genético usando primers genotipagem e as condições de reação do PCR do manuscrito do texto. Confirme o genótipo com um serviço de sequenciamento genético.
Coloque indivíduos G-um do mesmo genótipo em uma gaiola de rede, autocruze as progêneres G-1 e continue a tela usando os mesmos métodos. O local alvo do gene de interesse estava localizado em seu segundo exon. Este local foi altamente conservado e o fragmento de banda alvo do sgRNA de tamanho sintetizado foi confirmado usando eletroforese de gel agarose.
A detecção mutante de um único alvo sgRNA foi realizada sequenciando os produtos PCR de unidades parentais G-1. A eficácia do uso de pares de sgRNA não sobrepostos em diferentes exons foi demonstrada como a grande exclusão dos mutantes foi facilmente distinguida das panelas do tipo selvagem. Após a obtenção de um certo número de indivíduos mutantes, experimentos eletrofisiológicos ou comportamentais podem ser realizados para esclarecer a função genética e a interação entre diferentes genes.
