Этот рабочий процесс вскрытия и анализа обеспечивает новый подход к анализу полной морфологии отдельных желудочков вкусовых нервов, преобразования чисел типа клеток и физических отношений между клетками. Сбор всего лингвального эпителия позволяет измерить абсолютное количество клеток и объем иннервации внутри всего вкусового рецептора. Этот подход более точен, чем оценки структуры клеток, основанные на выборке из секций, что снижает техническую изменчивость.
Это также первый метод, обеспечивающий детальный анализ клеток вкусовых рецепторов по отношению к их иннервации. Этот метод может улучшить исследования потенциальной схемы во вкусовой рецепторе, а также болезненных процессов и химиотерапии, которые нарушают нормальную вкусовую функцию. В большинстве этих случаев неясно, какая структура или связь нарушены, поэтому сохранение всех этих факторов нетронутыми позволяет проводить все анализы в рамках одной подготовки.
Наиболее распространенной ошибкой является попытка избежать повреждения эпителия, не рассекая достаточно близко к нижней стороне эпителия. Крайне важно удалить как можно больше подлежащей ткани, прежде чем замораживать ткань в тканевой плесени. Также важно убедиться, что эпителий лежит ровно в нижней части тканевой плесени.
Начните с размораживания и промывания языка в 0,1 молярном фосфатном буфере. Затем поместите 1/2 переднего языка, содержащего грибовидные сосочки, на стеклянную горку под рассекающим микроскопом. Используйте тупые щипцы и ножницы для рассечения, чтобы удалить мышцу и держать ткань открытой, когда лингвальный эпителий изогнут, обеспечивая плоскую ориентацию ткани, сохраняя лопасти грубых ножниц для рассечения параллельно эпителию.
Отбросьте вентральный неорогатый эпителий языка, так как он не содержит вкусовых рецепторов. Затем используйте тонкие ножницы для рассечения для более близкого рассечения к нижней стороне ороговевшего эпителия. Используйте тупые щипцы, чтобы положить кусок эпителия в тканевую форму и убедиться, что он лежит ровно.
Затем добавьте каплю оптимальной температуры резки, или OCT, в ткань. Поместите тканевую форму на ранее охлажденную металлическую основу под рассекающим прицелом, затем продолжайте слегка постукивать по ткани щипцами, пока ОКТ не замерзнет, гарантируя, что ткань замерзнет как можно более плоской. Как только OCT замерзнет, быстро добавьте дополнительный OCT и поместите форму в стакан с охлажденным 2-метилбутаном до замораживания.
Установите форму OCT на криостат и разрежьте ее на 20-микронные секции. Соберите каждый участок и просмотрите его под световым микроскопом, чтобы оценить его близость к основанию эпителия. После того, как ткань выбрита с нижней стороны эпителия, разморозьте эпителий и дважды промойте его в 0,1 молярного ПБ на шейкере.
Отрежьте твердое небо спереди к соединению мягкого и твердого неба, затем отделите мягкое небо от подлежащей ткани, убедившись, что все оставшиеся фрагменты кости отрезаны и удалив дополнительную мышечную и соединительную ткань. Удерживайте небо тупыми щипцами и удалите оставшиеся железы и потеряйте соединительную ткань, аккуратно соскребая их лезвием бритвы. Целые вкусовые рецепторы и вся иннервация вкусовых рецепторов у мышей Phox2b-Cre TdTomato были помечены окрашиванием язычного эпителия антителами к DsRed и кератиновой восьмерке.
Объем вкусовых рецепторов был измерен и не выявил корреляций между объемами вкусовых рецепторов и объемами иннервации ни в грибовидной, ни в циркумвалляционной областях измерения. Введение низкой дозы тамоксифена мышам TrkB CreER TdTomato вызывает рекомбинацию генов и маркировку небольшого количества нейронов. Здесь показан цельный вкусовой рецептор, окрашенный маркерами карбоангидразы четырехугольной ангидразы и фосфолипазы С бета два.
Этот вкусовой рецептор имеет две маркированные концевые беседки, которые показаны с удалением вкусового рецептора после реконструкции волокон. Использование программного обеспечения для визуализации на основе клеточных пикселей для определения ближайшей близости между нервными волокнами и клетками, передающими вкус, показало, что из 19 клеток, преобразующих вкус, синяя терминальная беседка находилась в пределах 200 нанометров от светло-голубой карбоангидразы четыре плюс клетка. Терминальная беседка, связанная с зеленой трассировкой, показана в пурпурном цвете и находится в пределах 200 нанометров как от светлой, так и от темно-синей карбоангидразы четырех с лишним клеток.
Окрашивание цельноусатых кератиновых восьми и 5-этинил-2'дезоксиуридин или EdU грибовидных вкусовых рецепторов показало, что меченые EdU клетки присутствовали как внутри, так и снаружи вкусовых рецепторов. Пурпурные и фиолетовые ядра наблюдаются вне кератиновых восьми плюс граница вкусовой рецепторки. Желтые, чирковые и синие клетки находились внутри вкусовой рецептора.
При попытке этого протокола этапы рассечения и замораживания тканей имеют решающее значение. Эти методы рассечения тканей могут сопровождаться окрашиванием различных клеток и структур для анализа отношений как внутри вкусовой рецептора, так и вне вкусовой точки, но и внутри сосочки. Это первый анализ целых вкусовых беседок в пределах вкусовой рецептора, а также их взаимосвязи со вкусопередающими клетками.
Сохранение и окрашивание нескольких из этих элементов в одном препарате расширяет возможности для анализа и уточняет возможные измерения.
