Bu tüm montaj diseksiyon ve analiz iş akışı, bireysel tat sinir çardaklarının tam morfolojisini, hücre tipi sayılarını ve hücreler arasındaki fiziksel ilişkileri analiz etmek için yeni bir yaklaşım sağlar. Tüm lingual epitelin toplanması, tüm tat tokası içindeki mutlak hücre sayısını ve innervasyon hacmini ölçmemize izin verir. Bu yaklaşım, teknik değişkenliği azaltan bölümlerden örneklemeye dayalı hücre yapısı tahminlerinden daha doğrudur.
Bu aynı zamanda tat alma tomurcuk hücrelerinin innervasyonlarına göre ayrıntılı analizini sağlayan ilk yöntemdir. Bu yöntem, tat alma tomurcuklarındaki potansiyel devrelerin yanı sıra normal tat fonksiyonunu bozan hastalık süreçleri ve kemoterapilerle ilgili incelemeleri artırabilir. Bu vakaların çoğunda, hangi yapının veya ilişkinin bozulduğu belirsizdir, bu nedenle tüm bu faktörlerin bozulmadan sürdürülmesi, tüm analizlerin tek bir hazırlık içinde tutulmasına izin verir.
En yaygın hata, epitenin alt tarafına yeterince yakın bir şekilde parçalanmayarak epitelin zarar görmesinden kaçınmaya çalışmaktır. Doku kalıbındaki dokuyu dondurmadan önce mümkün olduğunca alttaki dokuyu çıkarmak zorunludur. Epitelin doku kalıbının dibinde düz bir şekilde uzanmasını sağlamak da önemlidir.
Dili 0,1 molar fosfat tamponunda eritip durulayarak başlayın. Daha sonra mantar biçimi papillasını içeren ön dilin 1/2'sini bir diseksiyon mikroskobu altında cam bir kaydırağa yerleştirin. Lingual epitel kavisli olduğu için kası çıkarmak ve dokuyu açık tutmak için künt uçlu epps ve diseksiyon makası kullanın, kaba diseksiyon makasının bıçaklarını epitele paralel tutarak dokunun düz bir yönünü sağlayın.
Tat alma tomurcukları içermediği için dilin ventral olmayan keratinize epitelini atın. Daha sonra keratinize epitelin alt kısmına daha yakın diseksiyon için ince diseksiyon makası kullanın. Bir epitel parçasını bir doku kalıbına koymak ve düz bir şekilde uzandığından emin olmak için künt uçlu tokalar kullanın.
Daha sonra dokuya bir damla optimum kesme sıcaklığı bileşiği veya OCT ekleyin. Doku kalıbını diseksiyon kapsamı altında daha önce soğutulmuş bir metal tabana yerleştirin, ardından OCT donana kadar dokuya hafifçe dokunmaya devam edin ve dokunun mümkün olduğunca düz donmasını sağlayın. OCT donduktan sonra, hızlı bir şekilde ek OCT ekleyin ve kalıbı donana kadar soğutulmuş 2 metilbütan bir kabın içine yerleştirin.
OCT kalıbını kriyostat üzerine monte edin ve 20 mikron bölüme kesin. Her bölümü toplayın ve epitel tabanına yakınlığını değerlendirmek için ışık mikroskobu altında görüntüleyin. Doku epitelin alt tarafından tıraş edildikten sonra, epitelleri çözün ve bir çalkalayıcı üzerinde 0,1 molar PB'de iki kez durulayın.
Sert damak ön ön kısmını yumuşak ve sert damak birleştiği yere kesin, ardından yumuşak damağı alttaki dokudan ayırın, kalan kemik parçalarının kesildiğinden emin olun ve ek kas ve bağ dokusunu çıkarın. Damak tadını künt uçlu forsepslerle tutun ve kalan bezleri çıkarın ve jiletle hafifçe kazıyarak bağ dokusunu kaybedin. Phox2b-Cre TdTomato farelerindeki tüm tat tomurcukları ve tüm tat tomurcuk innervasyonu, dil epitelinin DsRed ve keratin sekiz antikorları ile boyanarak etiketlendi.
Tat alma tomurcuk hacmi ölçüldü ve mantar formu veya sirkülasyon ölçüm bölgelerindeki tat alma tomurcuk hacimleri ile innervasyon hacimleri arasında hiçbir korelasyon olmadığını ortaya koydu. TrkB CreER TdTomato farelerinde düşük dozda tamoksifen verilmesi gen rekombinasyonuna ve az sayıda nöronun etiketlenmesine neden olur. Burada, tat dönüştürücü hücre belirteçleri karbonik anhidraz dört ve fosfolipaz C beta iki ile boyanmış tam bir tat tokası gösterilmiştir.
Bu tat alma tomurcukları, lifleri yeniden yapılandırdıktan sonra çıkarılan tat alma tomurcukları ile gösterilen iki etiketli terminal çardaklara sahiptir. Sinir lifleri ve tat dönüştürücü hücreler arasındaki en yakın yakınlığı belirlemek için hücre pikseli tabanlı görüntüleme yazılımının kullanılması, 19 tat dönüştürücü hücreden mavi terminal çardakının açık mavi karbonik anhidroz dört artı hücrenin 200 nanometresi içinde olduğunu ortaya koydu. Yeşil izleme ile ilişkili terminal çardak macenta olarak gösterilir ve hem açık hem de koyu mavi karbonik anhidraz dört artı hücrenin 200 nanometresi içindedir.
Bütün mount keratin sekiz ve 5-etirenil-2'deoksiformridin veya EdU mantar biçimi tat tomurcuklarının lekelenmeleri, EdU etiketli hücrelerin tat tomurcuklarının içinde ve dışında mevcut olduğunu ortaya koydu. Macenta ve mor çekirdekler, tat tomurcukunun keratin sekiz artı sınırının dışında gözlenir. Sarı, deniz mavisi ve mavi hücreler tat alma tomurcuklarının içindeydi.
Bu protokolü denerken, doku diseksiyonu ve donma adımları çok önemlidir. Bu doku diseksiyon yöntemleri, hem tat tozu içindeki hem de tat alma tomurcuklarının dışındaki, ancak papilla içindeki ilişkileri analiz etmek için çeşitli hücre ve yapılar için boyama ile takip edilebilir. Bu, tat tokası içindeki tüm tat çardaklarının ilk analizi ve tat dönüştürücü hücrelerle olan ilişkileridir.
Bu elementlerin birkaçını tek bir hazırlıkta korumak ve boyamak hem analiz olanaklarını genişletir hem de mümkün olan ölçümleri iyileştirir.
