זרימת עבודה זו של ניתוח וניתוח הרכבה שלמה מספקת גישה חדשנית לניתוח המורפולוגיה המלאה של ארבורים עצביים של טעם אישי, העברת מספרים מסוג תאים ויחסים פיזיים בין תאים. איסוף האפיתל הלשון כולו מאפשר לנו למדוד את המספר המוחלט של תאים ואת נפח הפנימיות בתוך כל בלוטות הטעם. גישה זו מדויקת יותר מהערכות של מבנה התא בהתבסס על דגימה מקטעים, מה שמפחית את השונות הטכנית.
זוהי גם השיטה הראשונה המספקת ניתוח מפורט של תאי בלוטות הטעם ביחס ל- innervation שלהם. שיטה זו יכולה לשפר את החקירות של המעגלים הפוטנציאליים בתוך בלוטות הטעם, כמו גם תהליכי מחלה וכימותרפיה המשבשים את תפקוד הטעם הרגיל. ברוב המקרים הללו, לא ברור איזה מבנה או מערכת יחסים משובשים, ולכן שמירה על כל הגורמים הללו ללא פגע מאפשרת את כל הניתוחים בתוך הכנה אחת.
הטעות הנפוצה ביותר היא לנסות להימנע מפגיעה באפיתל על ידי לא לנתח קרוב מספיק לחלק התחתון של האפיתל. זה הכרחי להסיר כמה שיותר רקמה הבסיסית ככל האפשר לפני הקפאת הרקמה בתבנית הרקמה. חשוב גם לוודא האפיתל שוכב שטוח בתחתית תבנית הרקמה.
התחל על ידי הפשרה ושטיפה של הלשון במאגר פוספט טוחן 0.1. לאחר מכן מניחים 1/2 מהלשון הזעירה המכילה את הפפילה הפטרייתית על מגלשת זכוכית מתחת למיקרוסקופ ניתוח. השתמש במלקחיים קהים ומספריים כדי להסיר את השריר ולהחזיק את הרקמה פתוחה כמו האפיתל הלינגואל מעוקל, הבטחת כיוון שטוח של רקמה על ידי שמירה על הלהבים של מספריים ניתוח גס במקביל לאפיתל.
להשליך את האפיתל הגחוני לא קרטין של הלשון כפי שהוא אינו מכיל בלוטות טעם. לאחר מכן להשתמש מספריים ביתוש עדין עבור ניתוח קרוב יותר לחלק התחתון של האפיתל קרטין. השתמש במלקחיים קהים כדי להניח חתיכת אפיתל לתוך תבנית רקמה ולהבטיח כי הוא שוכב שטוח.
לאחר מכן להוסיף טיפה של תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית, או OCT, לרקמה. מניחים את תבנית הרקמה על בסיס מתכת מקורר בעבר מתחת לטווח הניתוח, ולאחר מכן להמשיך להקיש על הרקמה בקלילות עם המלקחיים עד OCT קפא, להבטיח כי הרקמה קופאת שטוח ככל האפשר. לאחר OCT קפא, במהירות להוסיף OCT נוסף ומניחים את התבנית בכיסת של 2-מתילבוטן מקורר עד קפוא.
הר את עובש OCT על cryostat לחתוך אותו לתוך 20 מקטעים מיקרון. לאסוף כל קטע ולהציג אותו תחת מיקרוסקופ האור כדי להעריך את קרבתו לבסיס האפיתל. לאחר שהרקמה מגולחת מהיד תחתון האפיתל, מפשירים את האפיתל ושוטפים אותו פעמיים ב-0.1 PB טוחן על שייקר.
חותכים את החיך הקשה לצומת החיך הרך והקשה, ואז מפרידים את החיך הרך מהרקמה הבסיסית, מוודאים שכל שברי העצם הנותרים נחתכים ומוציאים שרירים ורקמת חיבור נוספים. החזק את החיך עם מלקחיים קהים ולהסיר את הבלוטות הנותרות לאבד רקמת חיבור על ידי גירוד בעדינות אותם עם סכין גילוח. בלוטות טעם שלם וכל פנימיות בלוטות הטעם בעכברים Phox2b-Cre TdTomato תויגו על ידי הכתמת האפיתל הלשון בנוגדנים ל- DsRed ו- keratin שמונה.
נפח בלוטות הטעם נמדד ולא גילה קשרים בין נפחי בלוטות הטעם וכרכים פנימיים בפטריות או באזורי מדידת ההיקף. הממשל של מינון נמוך של טמוקסיפן בעכברים TrkB CreER TdTomato גורם רקומבינציה גנים ותיוג של מספר קטן של נוירונים. בלוטות טעם של הר שלם מוכתמות בסמני תאים מתמרנים בטעם, אנהידראז קרבוני ארבע ופוספוליפאז C בטא 2 מוצג כאן.
בלוטות טעם זו יש שני arbors מסוף שכותרתו, אשר מוצגים עם בלוטות הטעם הוסר לאחר שחזור הסיבים. שימוש בתוכנת הדמיה מבוססת פיקסלים של תאים כדי לקבוע את הקרבה הקרובה ביותר בין סיבי עצב לתאי העברת טעם גילה שמתוך 19 תאים ממחליפים טעם, הארבור של המסוף הכחול היה בטווח של 200 ננומטר מהאנוהירז הקרבוני הכחול הבהיר ארבעה פלוס תאים. הארבור הסופי הקשור למעקב הירוק מוצג במגנטה והוא נמצא בטווח של 200 ננומטרים הן של האנהידריז הקרבוני הכחול הבהיר והן מהכחול הכהה ארבעה תאים פלוס.
קרטין הר שלם שמונה ו 5-אתניל-2'deoxyuridine או EdU כתמים של בלוטות טעם פטריות גילה כי תאים מתויגים EdU היו נוכחים בתוך ומחוץ לבלוטות הטעם. המגנטה והגרעין הסגול נצפים מחוץ לקרטין שמונה פלוס גבול בלוטות הטעם. התאים הצהובים, הצהבהבים והכחולים היו בתוך בלוטות הטעם.
כאשר מנסים פרוטוקול זה, ניתוח הרקמה וצעדי הקפאה הם מכריעים. שיטות ניתוח רקמות אלה יכולות להיות ואחריו כתמים עבור מגוון של תאים ומבנים כדי לנתח את היחסים הן בתוך בלוטות הטעם והן מחוץ לבלוטות הטעם, אבל בתוך הפפילה. זהו הניתוח הראשון של arbors טעם שלם בתוך בלוטות הטעם, כמו גם את היחסים שלהם עם תאים transducing טעם.
שמירה והכתמת חלק מהאלמנטים הללו בהכנה אחת מרחיבות את אפשרויות הניתוח ומעדנות את המדידות האפשריות.
