私たちは、エイミー·マイヤーズと技術的なスキルとヘルプのESI Quaysonに感謝します。この作品は、NSF 0216310とジボダン社の助成金（NER）によって部分的にサポートされていました。

1。人間の茸状の味覚乳頭を得る<ol><li>湾曲した春のmicroscissorsを使用して、舌の前部の背側表面に四から八人間の茸状の味覚乳頭を削除します。 </li><li>すぐにアイソレーション·ソリューションへの場所（26 mMの炭酸水素ナトリウム、2.5mMののNaH 2 PO 4、20mMのグルコース、65 mMのNaCl、20mMの塩化カリウム、1 mM EDTAをヌクレアーゼフリー水に溶解し、濾過滅菌）。 </li></ol> 2。人間の茸状の味覚乳頭消化人間の茸の味細胞の乳頭はわずかな違いを持つ2つの異なる酵素消化プロトコルを使用して解離させることができる。 <ol><li>プロナーゼ（1 mg / mlと、シグマアルドリッチ社）とエラスターゼ（1 mg / mlのシグマアルドリッチ社）の30-45分（プロトコル1）室温でのアイソレーション·ソリューションでインキュベートする茸状乳頭。 </li><li> +エラスターゼ（10 U / mLで、麦汁からコラゲナーゼI型（ワージントンから550 U / mLで、）でインキュベートする茸状乳頭用 hington）35の2 mlのカルシウムフリーリンゲル溶液中で+トリプシンインヒビター（ワージントンから0.9 mg / mLの）℃で30分間、95％O 2/5％CO 2で穏やかな酸素の循環を持つCの水浴。（代替方法消化、プロトコル2） </li><li>インキュベーション後、リンガーと乳頭を洗浄し、10回の火災研磨したガラスパスツールピペットを用いて乳頭をひいて粉にする。 </li><li>室温で2500 rpmで3分間遠心分離し、分離液を除去すると味細胞培養培地1 mlを加える。 </li><li>ガラス皿に消化茸状乳頭を転送します。 </li><li>手術の剃刀で軽く茸状乳頭の解剖。 </li><li>ラット尾コラーゲン1型コーティングしたカバースリップの上にクローニングシリンダーに解剖乳頭の250μlを添加します。 </li><li>各ウェルに味細胞培養培地1 mlを追加します。 </li></ol> 3。人間の茸状の味覚乳頭細胞の培養<ol><li>加湿で36℃でプレートをインキュベートインキュベーターは、5％CO 2を含む。 </li><li>完全培地の最初の変更前に2日間邪魔されずにインキュベータ内に置きます。それは1〜3日ではっきりと見えないかもしれませんが、味細胞は最終的には、コーティングされたカバースリップにバインドします。 </li><li>完全にプレートと媒体からクローニングシリンダーを取り外し、各ウェルに味細胞の培地1 mlを加える。 </li><li>すべての培地6-7日の1/3を交換します。より頻繁に、および/または完全に培地を変更しないでください。 </li><li>一日おきに、顕微鏡下で細胞の成長を確認してください。新しい細胞のほとんどは、細胞クラスターの下に成長します。細胞クラスターは、通常、新しく生成された細胞を残して培養2-3週間後にデタッチします。 </li><li>一度クローニングシリンダーの40-50％が味細胞の拡大に覆われて、36で2〜3分が0.25％（w / v）のトリプシン/ EDTAを用いて細胞をトリプシン処理℃に</li><li>部屋の温度で5分間3000rpmで遠心分離に続いて味細胞培養培地の3巻を追加し、15 mlチューブにウェルから細胞を転送ature。 </li><li>味細胞の培地1mlの上清と再懸濁し、細胞を除去する。 </li></ol> 4。人間の茸状の味覚乳頭細胞の増殖<ol><li> T25プレートに細胞を移し、味細胞の培地（通路0）の4ミリリットルを追加します。 36加湿インキュベーター中°Cで5％CO 2を含むで細胞を維持します。 </li><li>培養味細胞が100％コンフルエントに達するまで、すべての培地6-7日の1/3を交換します。この時点では、収穫に味細胞を有効にするには、0.25％（w / v）のトリプシン/ EDTA 36で2〜3分間℃を用いて細胞をトリプシン処理、滅菌PBSで細胞を洗浄</li><li>上記のように遠心分離した後、新鮮なT-75フラスコ（通路1）に完全に味細胞培地および転送細胞内で再懸濁する。 </li><li>すべての培地6-7日の1/3を交換します。より頻繁に、および/または完全に培地を変更しないでください。 </li><li>細胞はほぼ100％コンフルエントに達している4.3と4.4を繰り返します。 T75フラスコ中で1:4希釈以上に高いセルを分割時間の経過とともに細胞の十分な成長を維持するために。 </li></ol> 5。培養ヒト茸状の味覚乳頭細胞を凍結融解<ol><li>主要味細胞の株式を凍結するには、トリプシン処理した後（ステップ4.2）、3ミリリットルの完全味細胞培地、滅菌15 mlコニカル遠心チューブへの転送セルを追加します。室温で5分間2500rpmで遠心します。 </li><li>慎重に95パーセントのウシ胎児血清（FBS）および5％DMSOを含む凍結培地の適切な量と上清と穏やかに再懸濁した細胞を除去します。 </li><li>ラベル、滅菌cryovials、しっかりとキャップ、イソプロパノールを含む冷凍コンテナ内の場所にセルを転送します。前に液体窒素を無期限に転送するには、少なくとも一日のために-80℃の冷凍庫に配置します。 </li><li> 37℃で凍結初代ヒト茸状乳頭味細胞の場所のバイアルを解凍し℃の水浴まで層流細胞培養での作業中にだけ、（約1分）融解フード。 </li><li>滅菌した15mlのコニカル遠心チューブに細胞と凍結培地を転送し、味細胞培養培地5mlを追加します。 </li><li>室温で5分間2500rpmで遠心し。慎重に、完全な味細胞培養培地で上清を、穏やかに再懸濁した細胞を破棄し、滅菌したT-25組織培養フラスコに移す。 </li><li> 3〜4ステップに応じて培養細胞に進みます。 </li></ol> 6。代表的な結果文化の中で味の生検を成長させる試みは、時間の90％が成功した。生検および解離数日後、細胞は一般的に解離手順の後に残った解剖茸状組織の部分から外側に成長し、移行し始めました。個々の細胞がめっき（ 図1A）の後に表示されて24〜48時間であったが、細胞が時折娘細胞（ 図1B）を生成し、添付された細胞塊の下に2から3週間まで成長しました。生検から文化の中で4週間で8000個の細胞 - ING 4月8日人間の茸状乳頭は、プライマリ人間の茸状乳頭味細胞の最初の分離株は約2000に達する。さらに3-4週間のT25細胞培養フラスコ（通路1）の拡大は、培養中のヒトの茸状乳頭味細胞（ 図1C）に適応を有することになります。初代ヒト茸状乳頭味細胞はさらに3-4週間（ 図1D）の通路-1で少なくとも100万セルの上方を得るために培養で増殖することができます。主な味覚細胞が8つ以上の通路を拡大していきます。 培養中の培養ヒト茸状乳頭味細胞の形態は、以前は11,12に記載の培養化学感覚細胞に類似していた..ほとんどのヒト培養茸状乳頭味細胞は最大15-30日に1つまたは複数のプロセスの有無にかかわらず細胞体の元のコンパクトな外観を維持しています。彼らは、合流点に培養されたCEのほとんどに達した後LLSは、偏細長い外観を有していた。成熟した味細胞は、いくつかの異なる組織型と展示味細胞固有の機能で構成されています。ここでは、これらの培養内の細胞は、成熟味細胞の特徴的な多くの分子的および生理学的機能を表示することを示している。 GustducinとホスホリパーゼC - β2、（PLC-β2）mRNAが逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応およびシークエンシング（ 図2）によって確認された製品によって検出された。 gustducinおよびPLC-β2の発現は、免疫細胞化学II型様細胞（BとDはそれぞれ図3）の存在を示すが検出されました。有病率と細胞シグナル伝達経路や細胞の種類を反映してgustducinおよびPLC-β2の相対的な発現パターンを正確に生体内で見たことが反映されません。味蕾内の異なる細胞型の相対的な分布を支配する因子は不明であり、培養条件で複製することはできません。したがって、B<html>培養細胞とそのin vivoでの対応では、操作および監視することができる条件下で、分子レベルでこれらの特性の規制を検討する機会を提供するとの類似点と相違点をOTH。 モデルシステムのための重要な基準は、関連する機能的特性の存在である。培養細胞はまた、いくつかの味刺激の適切な濃度（ 図4）に応答して細胞内カルシウムの堅牢な増加を示した。これらの研究では、甘い、苦い刺激脱分極に対応することができる細胞内カルシウムの増加を誘発する。これらの味覚細胞様培養細胞の性質は、我々がここで説明するモデルシステムは、伝達経路とヒトの味覚細胞の再生能力の更なる研究のための貴重な資産となるという主張を支持する。 fig1.jpg &quot;/&gt; 図1添付ファイルおよび培養ヒト茸状乳頭味細胞の形態。コラーゲンタイプ1でコートしたプレート上に成長させた初代ヒト茸状の味覚乳頭細胞の培養は2日（）の後に撮像した。人間の茸状乳頭味細胞は娘細胞を生じるように見えた添付の細胞クラスターの下で4週間までのために成長しました。細胞は通常は4週間（B）内でコンフルエントになるまで成長し、（CとD）収穫とそれぞれ再シードした後2日目と4週を表します。培養細胞は、少なくとも8ヶ月間の成長を続けた。スケールバー= 50 nmである。 図1の部分もOzdener らに提示された。ら10。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3730/3730fig2.jpg" /> 図2 RT-PCRの結果は、特定味細胞マーカーのmRNA（gustducinおよびPLC-β2）の存在を実証した。培養ヒト茸状細胞からのトータルRNAは、逆transcでしたRT-PCR用スーパースクリプトファーストストランド合成システム（Invitrogen）を用いてribedとgustducinおよびPLC-β2の検出のために設計された特異的なプライマーで増幅することによりPCRに使用されます。プライマー（ 表1）が 1以上のイントロンにまたがるように選ばれました。各mRNAは、配列決定によって確認し予想されるサイズの増幅産物との通路4または5から培養したヒト茸状乳頭味細胞で検出されました。特定のmRNAはなく、ゲノムDNAの混入がないことを示す逆転写酵素なしでの対照実験では検出されなかった。 PCR産物を2％アガロースゲル上で分離し、ゲル上の増幅産物はカミソリで切り出した。 DNAをQIAquickゲル抽出キット（Qiagen）を用いてゲルから抽出した。 PCR産物は、ペンシルベニア州シーケンシング施設の大学で配列決定した。 C-PCRおよびC-RTは、それぞれPCRおよび逆転写酵素の制御実験である。 図2の部分はまたOzdener らに提示された。アル。 <sup&gt; 10。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3730/3730fig3.jpg" /> 培養ヒト茸状乳頭味細胞の継代4または5の図3。免疫染色では、味細胞マーカーの存在を示した。培養ヒト茸状乳頭味細胞（5日齢）4℃で一晩（表2）4％パラホルムアルデヒドで固定し、一次抗体とともにインキュベートした画像は、ライカTCS-SP2共焦点レーザー走査型顕微鏡で得られた。約、培養された茸状乳頭味細胞の60％がgustducin（B）とPLC-β2（D）20〜30％で標識した。対応するセルの透過画像（AとC）が表示されます。コントロールでは、抗体特異的免疫グロブリンと免疫染色は、非特異的免疫反応性（データは示さず）が存在しないことを実証した。スケールバー= 50 nmである。一部図3のまたOzdener らに提示された。ら10。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3730/3730fig4.jpg" /> 図4。通路4または5から培養ヒト茸状乳頭味細胞は様々な刺激に応答します。培養ヒト茸状乳頭味細胞（4-5日齢）1mMのフラ-2 AM（Molecular Probes社）および10 mg / mlのプルロニックF127（Molecular Probes）でロードされていました。培養ヒト茸状乳頭味細胞の細胞内カルシウム濃度（[Ca 2 +] iの）の変化は、標準的な手動のイメージング技術を用いて測定した。細胞は、340nmおよび380nmの励起波長で倒立蛍光顕微鏡および510nmを中心とするバンドパスフィルタによって設定され、発光波長を用いて可視化した。必要に応じて刺激は浴溶液に溶解し、次いでpHおよび浸透圧を再調整しました。培養ヒト茸状の味覚乳頭細胞は、甘いと苦い刺激に反応した。 Graphs（B）は、スクラロース（1 mM）を、（）デナトニウム（2 mm）に露光中に、個々の細胞での[Ca 2] iのレベルの代表的な反応を示しています。各トレースは、単一の、個々のセルを表します。 <table border="1"><tbody><tr><td> 遺伝子 </td><td> シーケンス </td><td colspan="2"> PCR条件 </td><td> 予想されるサイズ （BP） </td><td> リファレンス </td></tr><tr><td> β-アクチン</td><td> GGACTTCGAGCAAGAGATGG AGCACTGTGTTGGCGTACAG </td><td> 7分 45秒 45秒 45秒 7分</td><td> 95 94 53 72 72 </td><td> 234 </td><td> NM_001101.3 </td></tr><tr><td> Gustducin </td><td> TCTGGGTATGTGCCAAATGA GGCCCAGTGTATTCTGGAAA </td><td> 7分 45秒 45秒 45秒 7分</td><td> 95 94 53 72 72 </td><td> 386 </td><td> NM_001102386 </td></tr><tr><td> PLC-β2 </td><td> GTCACCTGAAGGCATGGTCT TTAAAGGCGCTTTCTGCAAT </td><td> 3分 30秒 30秒 60秒 7分</td><td> 95 94 53 72 72 </td><td> 333 </td><td> NM_004573 </td></tr></tbody></table> 表1。味特定の分子を検出するために使用したプライマーおよび条件。 <table border="1"><tbody><tr><td> 一次抗体 </td><td> ソース </td><td> ホスト </td><td> 希釈 </td><td> 二次抗体 </td><td> ソース </td><td> ホスト </tD&gt; <td> 希釈 </td></tr><tr><td> Gustducin </td><td>サンタクルス</td><td>ウサギ</td><td> 1:500 </td><td>抗ウサギIgGアレクサ633 </td><td>分子プローブ</td><td>ヤギ</td><td> 1:500 </td></tr><tr><td> PLC-β2 </td><td>サンタクルス</td><td>ウサギ</td><td> 1:500 </td><td>抗ウサギIgGアレクサ633 </td><td>分子プローブ</td><td>ヤギ</td><td> 1:500 </td></tr></tbody></table> 表2。抗体の特定の分子の発現を検出するために使用されます。

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	<li>Mbiene, J. P., Maccallum, D. K., Mistretta, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+cultures+of+embryonic+rat+tongue+support+tongue+and+gustatory+papilla+morphogenesis+in+vitro+without+intact+sensory+ganglia.">Organ cultures of embryonic rat tongue support tongue and gustatory papilla morphogenesis in vitro without intact sensory ganglia.</a> J. Comp. Neurol. 377, 324-340 (1997).</li><li>Miyamoto, T., Fujiyama, R., Okada, Y., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+difference+in+amiloride-sensitivity+of+salt-induced+responses+in+mouse+non-dissociated+taste+cells.">Strain difference in amiloride-sensitivity of salt-induced responses in mouse non-dissociated taste cells.</a> Neurosci. Lett. 277, 13-16 (1999).</li><li>Caicedo, A., Jafri, M. S., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+Ca2++imaging+reveals+neurotransmitter+receptors+for+glutamate+in+taste+receptor+cells.">In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells.</a> J. Neurosci. 20, 7978-7985 (2000).</li><li>Qin, Y. M., Shi, J. Q., Zhang, G. H., Deng, S. P., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reliable+method+to+obtain+cells+of+taste+buds+from+fungiform+papillae+of+mice.">A reliable method to obtain cells of taste buds from fungiform papillae of mice.</a> Acta Histochem. 112, 107-112 (2010).</li><li>Spielman, A. I., Mody, I., Brand, J. G., Whitney, G., MacDonald, J. F., Salter, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+isolating+and+patch-clamping+single+mammalian+taste+receptor+cells.">A method for isolating and patch-clamping single mammalian taste receptor cells.</a> Brain Res. 503, 326-329 (1989).</li><li>Kishi, M., Emori, Y., Tsukamoto, Y., Abe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+rat+taste+bud+cells+that+retain+molecular+markers+for+taste+buds+and+permit+functional+expression+of+foreign+genes.">Primary culture of rat taste bud cells that retain molecular markers for taste buds and permit functional expression of foreign genes.</a> Neuroscience. 106, 217-225 (2001).</li><li>Ruiz, C. J., Stone, L. M., McPheeters, M., Ogura, T., Bottger, B., Lasher, R. S., Finger, T. E., Kinnamon, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+rat+taste+buds+in+primary+culture.">Maintenance of rat taste buds in primary culture.</a> Chem. Senses. 26, 861-873 (2001).</li><li>Stone, L. M., Tan, S. S., Tam, P. P., Finger, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+lineage+relationships+in+taste+buds.">Analysis of cell lineage relationships in taste buds.</a> J. Neurosci. 22, 4522-4529 (2002).</li><li>Ozdener, H., Yee, K. K., Cao, J., Brand, J. G., Teeter, J. H., Rawson, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+long-term+maintenance+of+rat+taste+cells+in+culture.">Characterization and long-term maintenance of rat taste cells in culture.</a> Chem. Senses. 31, 279-290 (2006).</li><li>Ozdener, M. H., Brand, J. G., Spielman, A. I., Lischka, F. W., Teeter, J. H., Breslin, P. A., Rawson, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Human+Fungiform+Papillae+Cells+in+Culture.">Characterization of Human Fungiform Papillae Cells in Culture.</a> Chem. Senses. 36, 601-612 (2011).</li><li>Gomez, G., Rawson, N. E., Hahn, C. G., Michaels, R., Restrepo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+odorant+elicited+calcium+changes+in+cultured+human+olfactory+neurons.">Characteristics of odorant elicited calcium changes in cultured human olfactory neurons.</a> J. Neurosci. Res. 62, 737-749 (2000).</li><li>Wolozin, B., Sunderland, T., Zheng, B. B., Resau, J., Dufy, B., Barker, J., Swerdlow, R., Coon, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+culture+of+neuronal+cells+from+adult+human+olfactory+epithelium.">Continuous culture of neuronal cells from adult human olfactory epithelium.</a> J. Mol. Neurosci. 3, 137-146 (1992).</li><li>Wick, N., Saharinen, P., Saharinen, J., Gurnhofer, E., Steiner, C. W., Raab, I., Stokic, D., Giovanoli, P., Buchsbaum, S., Burchard, A., Thurner, S., Alitalo, K., Kerjaschki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomal+comparison+of+human+dermal+lymphatic+endothelial+cells+ex+vivo+and+in+vitro.">Transcriptomal comparison of human dermal lymphatic endothelial cells ex vivo and in vitro.</a> Physiol. Genomics. 17, 179-192 (2007).</li><li>Fu, L., Zhu, L., Huang, Y., Lee, T. D., Forman, S. J., Shih, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+neural+stem+cells+from+mesenchymal+stemcells:+evidence+for+a+bipotential+stem+cell+population.">Derivation of neural stem cells from mesenchymal stemcells: evidence for a bipotential stem cell population.</a> Stem Cells Dev. 17, 1109-1121 (2008).</li><li>Sandow, S. L., Grayson, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limits+of+isolation+and+culture:+intact+vascular+endothelium+and+BKCa.">Limits of isolation and culture: intact vascular endothelium and BKCa.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 297, H1-H7 (2009).</li></ol>

利害の衝突が宣言されません。

私たちは12ヶ月の期間にまたがる、8以上の通路のために人間の茸状乳頭味から得られた細胞を維持しています。これらの培養物は、味覚受容体細胞の重要な分子的及び生理学的性質に加えて、成熟した味蕾細胞の種類にはいくつかのマーカーを発現した段階にin vitroで成熟し、その多くは新しい細胞を生成します。 gustducinと培養細胞のサブセットのPLC-β2免疫反応の存在は、この結論と...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td></tr><tr><td> MCDB 123 </td><td> Sigma-Aldrich社</td></tr><tr><td>イスコフDMEM培地</td><td>メディアテック</td></tr><tr><td>エラスターゼ</td><td> Sigma-Aldrich社</td></tr><tr><td>プロナーゼE </td><td> Sigma-Aldrich社</td></tr><tr><td>エラスターゼ</td><td>ワージントン</td></tr><tr><td>大豆トリプシンインヒビター</td><td>ワージントン</td></tr><tr><td>コラゲナーゼタイプ1 </td><td>ワージントン</td></tr><tr><td>ラットテールコラーゲンタイプ1 </td><td> BD科学</td></tr><tr><td> AMフラ-2 </td><td>分子プローブ</td></tr><tr><td> RT-PCRのための上付き文字ファーストストランド合成システム</td><td>インビトロジェン</td></tr><tr><td>ライカTCS SP2スペクトル共焦点顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ株式会社</TD&gt; </tr><tr><td>ディスカバリー-1イメージングステーションおよびMetaMorphソフトウェア</td><td>モレキュラーデバイス</td></tr><tr><td>小さな細かいチップ鉗子と​​極細スプリングはさみ</td><td>ファイン科学ツール</td></tr></tbody></table>

isolation and culture of human fungiform taste papillae cells

味細胞は、食品中に含まれる単純な刺激と複雑な化学分子の広い範囲の検出を可能にするユニークな組織学的、分子生物学的および生理学的特性を持つ、高度に特殊化されています。ヒトでは、個々の茸状乳頭はゼロから多くの20の味蕾に含まれています。複数のセルサイクルの文化の味覚乳頭細胞を維持する能力は、これらのユニークな感覚細胞の、分子の再生、および機能的性質を特徴づけるためにかなりのユーティリティのでしょうが培養ヒトの味覚細胞のための確立されたプロトコルは、ありません。味細胞の以前の研究はげっ歯類、または組織切片1,2,3,4の半そのままの味蕾から、初代培養の外植片培養を新たに単離された細胞を使用して行われている。これらの製剤のそれぞれの利点がありますが、長期的な文化の発展は、特に味細胞の増殖とdiffeの研究に、大きなメリットを提供しているだろうrentiation。我々を含むいくつかのグループが、味細胞培養モデルの開発と確立に興味を持っています。文化の味細胞にほとんどの試みは3-5 D 5,6,7,8を超えて一般的に長続きしない細胞と、限られた可能性が報告されています。我々は最近、9齧歯類の味細胞の拡張された文化のために成功した方法を報告した。我々はここで初めて単離されたヒト茸状乳頭味細胞のin vitroの培養系の確立を報告します。生検で得られたヒト茸状乳頭由来の細胞が正常に生存率の低下なしに個以上の通路（12ヶ月）培養で維持した。細胞が成熟した味細胞の特徴多くの分子的および生理学的機能を表示します。 GustducinとホスホリパーゼCβ2、（PLC-β2）mRNAが逆転写酵素 - ポリメラーゼ連鎖反応によって、多くの細胞で検出され、配列決定によって確認した。免疫細胞化学分析では、突風の存在を実証ducinおよびPLC-β2培養味細胞における発現。培養ヒト茸状細胞は、味覚受容体とシグナル伝達経路の少なくとも一部が存在していたことを示すいくつかの味刺激の適切な濃度に応答して細胞内カルシウムの増加を示した。これらの結果は、十分な成人から味細胞が生成され、少なくとも8つの通路を維持できることを示しています。細胞の多くは、モデルの味覚システムとしての使用をサポートするために、大人の味の上皮から急性単離した細胞の生理学的および生化学的特性を保持します。このシステムは、in vitroでの準備中で哺乳類の味覚受容体細胞の増殖、分化および機能に関与するプロセスの更なる研究が可能になります。 ヒトの茸状細胞の培養を確立するために使用される人間の茸状乳頭味が見直された研究プロトコルの下で適切なインフォームドコンセント後に研究のために寄付されましたとIRB委員会によって承認されました。プロトコル（＃0934）は、シュルマンアソシエイツ機関審査委員会（株）、シンシナティ、オハイオ州によって承認されました。下記の書かれたプロトコルはOzdener らによって報告され公表されたパラメータに基づいています。 2011年10。

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Isolation and Culture of Human Fungiform Taste Papillae Cells

我々は人間の茸状乳頭味細胞の長期培養を分離して維持するための再現可能なプロトコルを開発することを目的とした。生検で得られたヒト茸状乳頭由来の細胞が正常に生存率の低下なしに個以上の通路（12ヶ月）培養で維持した。

人間の茸状の味覚乳頭細胞の単離および培養

Taste cells are highly specialized, with unique histological, molecular and physiological characteristics that permit detection of a wide range of simple ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.3K ビュー.  Monell Chemical Senses Center. 我々は人間の茸状乳頭味細胞の長期培養を分離して維持するための再現可能なプロトコルを開発することを目的とした。生検で得られたヒト茸状乳頭由来の細胞が正常に生存率の低下なしに個以上の通路（12ヶ月）培養で維持した。

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Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a well-characterized niche for adult stem cells1. This segment of the outer root sheath contains a number of different types of stem cells, including epithelial stem cells2, melanocyte stem cells3 and neural crest like stem cells4-7. Hair follicles represent an accessible and rich source for different types of human stem cells. We and others have isolated neural crest stem cells (NCSCs) from human fetal and adult hair follicles4,5. These human stem cells are label-retaining cells and are capable of self-renewal through asymmetric cell division in vitro. They express immature neural crest cell markers but not differentiation markers. Our expression profiling study showed that they share a similar gene expression pattern with murine skin immature neural crest cells. They exhibit clonal multipotency that can give rise to myogenic, melanocytic, and neuronal cell lineages after in vitro clonal single cell culture. Differentiated cells not only acquire lineage-specific markers but also demonstrate appropriate functions in ex vivo conditions. In addition, these NCSCs show differentiation potential toward mesenchymal lineages. Differentiated neuronal cells can persist in mouse brain and retain neuronal differentiation markers. It has been shown that hair follicle derived NCSCs can help nerve regrowth, and they improve motor function in mice transplanted with these stem cells following transecting spinal cord injury8. Furthermore, peripheral nerves have been repaired with stem cell grafts9, and implantation of skin-derived precursor cells adjacent to crushed sciatic nerves has resulted in remyelination10. Therefore, the hair follicle/skin derived NCSCs have already shown promising results for regenerative therapy in preclinical models.
Somatic cell reprogramming to induced pluripotent stem (iPS) cells has shown enormous potential for regenerative medicine. However, there are still many issues with iPS cells, particularly the long term effect of oncogene/virus integration and potential tumorigenicity of pluripotent stem cells have not been adequately addressed. There are still many hurdles to be overcome before iPS cells can be used for regenerative medicine. Whereas the adult stem cells are known to be safe and they have been used clinically for many years, such as bone marrow transplant. Many patients have already benefited from the treatment. Autologous adult stem cells are still preferred cells for transplantation. Therefore, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin/hair follicles are a valuable source for regenerative medicine.

This article presents a robust protocol for isolation and culture of neural crest stem cells from human hair follicles.

人間の毛包から神経堤幹細胞の単離および培養

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

神経科学

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in glioblastoma mutliforme (GBM), is to identify and isolate tumor initiating cell population(s) to investigate their role in tumor formation, progression, and recurrence. Understanding tumor initiating cell populations will provide clues to finding effective therapeutic approaches for these tumors. The neurosphere assay (NSA) due to its simplicity and reproducibility has been used as the method of choice for isolation and propagation of many of this tumor cells. This protocol demonstrates the neurosphere culture method to isolate and expand stem-like cells in surgically resected human GBM tumor tissue. The procedures include an initial chemical digestion and mechanical dissociation of tumor tissue, and subsequently plating the resulting single cell suspension in NSA culture. After 7-10 days, primary neurospheres of 150-200 &mu;m in diameter can be observed and are ready for further passaging and expansion.

This video protocol demonstrates the isolation and expansion of stem like cells from surgically resected human glioblastoma mutliforme (GBM) tumor tissue using the neurosphere assay culture method.

ニューロスフェアのアッセイを用いたヒト多形性膠芽腫の腫瘍細胞の単離と拡大

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

胎児マウスから海馬ニューロンの単離および培養

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied successfully to the isolation of mouse and human primary neurons and neural progenitors. Dissociated neurons are maintained in serum-free medium up to several weeks. These cultures can be used for nucleofection, immunocytochemistry, nucleic acids preparation, as well as electrophysiology. Older neuronal cultures can also be transfected with a good efficiency rate by lentiviral transduction and, less efficiently, with calcium phosphate or lipid-based methods such as lipofectamine.

We describe a rapid methodology to isolate and culture hippocampal and cortical neurons from rodent embryos. This protocol allows us to perform experiments in which nearly pure neuronal cultures are required.

ラット胚神経細胞の分離と文化：クイックプロトコル

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

胎児マウス神経管から神経堤細胞の単離および培養

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrocytes are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be learned about their molecular and functional characteristics. In vitro astrocyte cell culture systems can be used to study the biological functions of these glial cells in detail. This video protocol shows how to obtain pure astrocytes by isolation and culture of mixed cortical cells of mouse pups. The method is based on the absence of viable neurons and the separation of astrocytes, oligodendrocytes and microglia, the three main glial cell populations of the central nervous system, in culture. Representative images during the first days of culture demonstrate the presence of a mixed cell population and indicate the timepoint, when astrocytes become confluent and should be separated from microglia and oligodendrocytes. Moreover, we demonstrate purity and astrocytic morphology of cultured astrocytes using immunocytochemical stainings for well established and newly described astrocyte markers. This culture system can be easily used to obtain pure mouse astrocytes and astrocyte-conditioned medium for studying various aspects of astrocyte biology.

Astrocytes have been recognized to be versatile cells participating in fundamental biological processes that are essential for normal brain development and function, and central nervous system repair. Here we present a rapid procedure to obtain pure mouse astrocyte cultures to study the biology of this major class of central nervous system cells.

マウス大脳皮質アストロサイトの単離および培養

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

胚前脳からの内皮細胞の単離および培養

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Denver Papillae Protocol for Objective Analysis of Fungiform Papillae

The goal of the Denver Papillae Protocol is to use a dichotomous key to define and prioritize the characteristics of fungiform papillae (FP) to ensure consistent scoring between scorers. This protocol builds off of a need that has arisen from the last two decades of taste research using FP as a proxy for taste pore density. FP density has historically been analyzed using Miller &#38; Reedy&#8217;s 1990 characterizations of their morphology: round, stained lighter, large, and elevated. In this work, the authors forewarned that stricter definitions of FP morphology needed to be outlined. Despite this call to action, follow up literature has been scarce, with most studies continuing to cite Miller &#38; Reedy&#8217;s original work. Consequently, FP density reports have been highly variable and, combined with small sample sizes, may contribute to the discrepant conclusions on the role of FP in taste sensitivity. The Genetics of Taste Lab explored this apparent inconsistency in counting and found that scorers were individually prioritizing the importance of these characteristics differently and had no guidance for when a papilla had some, but not all, of the reported qualities of FP. The result of this subjectivity is highly variable FP counts of the same tongue image. The Denver Papillae Protocol has been developed to remedy this consequence through use of a dichotomous key that further defines and prioritizes the importance of the characteristics put forth by Miller &#38; Reedy. The proposed method could help create a standard way to quantify FP for researchers in the field of taste and nutritional studies.

Here we present a protocol to measure fungiform papilla density from digital photographs. This method builds prioritization and objective characteristic metrics into the original descriptive work on fungiform papillae by Miller &#38; Reedy (1990).

茸乳頭の客観的な分析のためのデンバー乳頭プロトコル

The goal of the Denver Papillae Protocol is to use a dichotomous key to define and prioritize the characteristics of fungiform papillae (FP) to ensure ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

マウス梁下ゾーンから成体神経幹細胞の単離および培養

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.