このプロトコルは、重要な深部静脈血栓症を治療するための代替非侵襲的アプローチである、肝細胞性助診血症またはリソトリップスの作用の有効性および作用メカニズムを評価するためのベンチトップ法を提供する。この技術は、気泡活性を使用して、血栓内の増加した滑液送達および赤血球の血化による線維化症の増加による双方向効果を有する。深部静脈血栓症を治療するためのこのベンチトップアプローチは、血栓のモデリング、リソトリプシーによる治療、および治療中の同時イメージングを容易にする。
バブルクラウド生成、治療計画、画像誘導は、腎臓腫瘍や肝臓腫瘍などの他の疾患のインビトロ組織ストリップベースの治療法をさらに調査するために使用することができます。ヒストトリップのソースを設定するには、モーターを使用したポジショニングシステムにソースを取り付けます。イメージングアレイをプローブカバーで覆い、ヒストトリップのソースの開口部にアレイを同軸で固定します。
画像アレイを超音波スキャンシステムに接続し、タンク内のヒストトリップスソースとイメージングアレイを完全に水没させます。シリンジを使用して気泡を静かに取り除き、イメージングアレイとスキャナを使用して、毎秒20フレームで脱気Bモードの水画像を取得します。画像を取得しながら、共焦点トランスデューサの開口部内の撮像アレイの位置を、泡雲が画像ウィンドウの中心に位置し、検出された焦点位置を撮像ウィンドウに記録します。
その後、インソネーションを中止し、ヒストトリップのソースに印加される電圧をゼロに設定します。分析用の血栓を調製するには、プライヤーを使用して血栓を含むピペットの密閉された端部を切断し、血栓と血清をシャーレにスライドさせます。メスを使用して血栓を1センチメートルの長さにカットし、クリーニングワイプを使用してカットセクションを静かにブロットして余分な液体を取り除きます。
ピンセットを使用して、凝固器のセクションを慎重にスケールに配置し、重量を記録します。次に、脱気逆浸透水タンクから流路を手動で上げ、チャネルからモデル容器を取り外します。ピンセットを使用して、血栓を損傷することなく慎重にモデル容器に血栓を配置し、船を流路に取り付けます。
貯蔵所に対するステージの近位端が遠位側に比べて低くなるようなタンクに流路を下げ、ピペットを使用して37°Cの加温プラズマを30マイクロリットルの加温したプラズマを貯留槽に加える。水タンクの温度を少なくとも摂氏36度に達するまで監視し、ピペットを使用して80.4マイクログラムのrt-PAをプラズマ貯留層に加えます。流路を盛り付けるには、シリンジポンプを使用して、モデル容器が満杯になるまで、貯留層からチャネルにプラズマを引き込みます。
次に、モデル容器を手動でレベル設定して、イメージングウィンドウ内に見られるように、モデル容器に気泡が存在しないようにします。血栓の長さに沿って均一なヒストトリップス露光のためのヒストトリップス源とイメージングアレイのパスを計画するには、イメージングスクリプトを使用して、血栓の長さに平行なイメージングアレイを位置合わせし、容器内に気泡がないことを確認します。電動ポジショナーを使用して、イメージング平面が血栓の断面に平行になるようにイメージングアレイを位置合わせします。
イメージングウィンドウをガイドとして使用して、リザーバに対して、近位の血栓の端部にヒストトリップのソースを移動します。血栓の長さに沿ったインソネーション パスを決定するには、血栓の長さに沿ったウェイポイントを 5 ミリずつ設定します。各ウェイポイントを確定する前に、ヒストトリップスソースからの火災テストパルスは、実証済みと同じインソネーションパラメータを使用しますが、全体的な露出は合計10パルスに減少しました。
各ウェイポイントで、製造元が指定したコマンドを使用してモーターの位置を保存します。前処理ステップで定義された経路に従って血栓をその長さに沿って治療するには、注射器ポンプを毎分0.65ミリリットルに設定し、プラズマの半月板が動くのを待ちます。確立されたウェイポイント間の中間ステップを含む処理パスを固定ステップサイズで補間し、ポジショナーを使用して、元々設定されたインソネーションパラメータを使用して、各パス位置でヒストトリップソースを移動します。
次に、各場所でヒストトリップパルスを適用する数秒前に、血栓とモデル容器のBモード画像を取得するようにイメージングアレイを設定するスクリプトを作成します。その後、各ウェイポイントでヒストトリップパルスを適用し、スクリプト内の音響放出を取得して、解析後に受動的キャビテーション画像を形成します。イメージングウィンドウを使用して、各パス位置でのヒストトリップスパルスの適用中にバブルのアクティビティを画像化します。
解析後、モデル容器を水槽から手動で上げて、重力によってパーフューズを排出し、シリンジポンプを使用して流路からプラズマ溶液を引き出し、小さなビーカーにパーフューザート全体を収集できるようにします。モデル容器を外し、血栓を取り外します。その後、ラボ組織で血栓を拭き、血栓の重量を量って血栓質量損失を評価します。
ヒストトリップス源に十分な電圧を印加すると、トランスデューサの焦点領域に気泡雲が生成され、超音波画像を介して可視化される。焦点位置は、バブル雲の中心として定義されます。この対照は、プラズマ単独に曝露された血栓の透過物、およびリソトリプシー処理血栓のこのパーフューズトを、実証されるようにヘモグロビンおよびD二量体含有量を評価するために使用された。
ヘモグロビン濃度のばらつきは、光学吸光度によって定量することができる。ここでは、組織上の露出の前にBモードイメージングを介してモデル容器内で血栓を可視化し、受動キャビテーション画像のセグメンテーションのための血栓位置を決定することができる。血栓のBモード画像と共に登録されたこの受動キャビテーション画像が確認したように、音響エネルギーは、ヒストリシー暴露の間に主に血栓内に含まれる。
ヒストトリップに曝露されたサンプルでは、破壊は主に血栓中心に限定され、受動的キャビテーションイメージングを介して追跡された気泡活動の観測位置と一致する。リティックの添加により、塊の損失は血塊の周囲に近い領域でも起こる。あるいは、rt-PAを含むエコゲンリポソームを全身性rt-PA送達の代わりに使用して、血栓への標的薬物送達の評価を可能にすることができる。
リソトリップシーは、多くの疾患の治療に代替非侵襲的アプローチを提供する。このin vitroプロトコルは、インビボアプリケーションにおける治療の有効性とその潜在的な成功の評価を可能にする。
