この作品は、韓国国立研究財団（NRF- 2012R1A6A3A040395、NRF-2013R1A1A2057708、NRF- 2012R1A1A1011023）を通じて2014年KAIST資金によるK-バレーRED＆Bプロジェクトと基礎科学研究開発プログラムでサポートされています。

注意：発ガン性アセトンとクロロホルムの使用前に製品安全データシート（MSDS）を参照してください。 フラット空気 - 水界面でのリン脂質単分子膜の作製<ol><li>リン脂質単分子層の形成<ol><li>リン脂質溶液の調製<ol><li>アセトン、エタノール、および脱イオン水を少なくとも3回を使用して、ポリテトラフルオロエチレンコーティングされたキャップでバイアル、および水を取り除くためにバイアル中に充分に窒素ガスを吹き付けるmlの4を清掃してください。 </li><li>濃度1mg / mlのを得るために、バイアル中のクロロホルム1mlにリン脂質1mgの（例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン、DOPC）を溶解します。安全のためにヒュームフード内でこの手順を実行します。必要に応じて、リン脂質溶液のより低いまたはより高い濃度を使用してください。 </li><li>染料を追加したリン脂質のソリューの1モル％未満でリン脂質（例えば、ローダミンジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ローダミンDPPE）をタグ付けン、蛍光顕微鏡を用いてリン脂質単分子層を可視化するためです。安全のためにヒュームフード内でこの手順を実行します。 </li><li>溶媒の蒸発を防止するために、ポリテトラフルオロエチレンテープでバイアルをラップし、-20℃の冷凍庫でサンプルを保存します。 </li></ol></li><li>空気 - 水界面へのリン脂質の沈着<ol><li>ペトリ皿（直径55ミリメートル、高さ12ミリメートル）エタノール、および脱イオン水を少なくとも3回清掃してください。 </li><li>空気 - 水界面を作成するために、脱イオン水10mlでペトリ皿を埋めます。 </li><li>所望の表面圧力を達成するためにクリーンなインターフェイス上にマイクロシリンジを用いてリン脂質溶液の数マイクロリットルを広げ、実験前をやっに、溶媒を完全に蒸発させるために、少なくとも30分間待ちます。 注：ラングミュアトラフは、表面圧力の正確な制御が必要な場合に代えて、ペトリ皿を用いることができます。 </li></ol></li></ol></li><li>蘇rface圧測定<ol><li>ウィルヘルミー板張力を有するリン脂質単分子膜の表面圧を測定します。濾紙をウィルヘルミー板として使用されている場合は、フィルター紙は十分に湿らせ得るために、少なくとも30分間待ちます。詳細なプロトコールは、クーンらで利用可能です。20。 </li><li>正確に面圧を制御するために、リン脂質の付着量を調整します。 〜5 MN / mの表面圧の場合、インタフェースの30.25センチメートル2 -areaにDOPC溶液（1mg / ml）の4μLを追加が必要です。 注：濾紙が完全に湿潤していない場合は、面圧が原因濾紙の重量変化を、実験の最初の30分の間に劇的に変化します。 </li></ol></li><li>単層の対流の最小化<ol><li>の対流を抑制するために、ペトリ皿の大部分に接続された2つの薄いチャネルを有する3mmのリザーバーを含み、円錐状の装置を使用して形態イメージングと面圧測定を妨害することができ、単層、。 </li><li>リン脂質は、空気 - 水界面にリン脂質を堆積させる前に、全領域にわたって自由に移動することを確実にするために、円錐状の装置の内部と外部との間の水のレベルが一致することを確認します。 </li></ol></li></ol>液滴の曲面でリン脂質単分子膜の作製<ol><li>マイクロピペットプラーを使用して、ガラスキャピラリーのプロセスを先細り<ol><li>マイクロピペットプラーのキャピラリーホルダーにガラスキャピラリー（OD 1ミリメートル、ID 0.78ミリメートル、長さ100ミリメートル）を配置します。 </li><li>適切なパラメータ値（：ランプ、引き出し：60、ヴェル：70、ディレイ：熱70と圧力200）と毛細血管を引くためのプログラムを設計し、製造業者のプロトコルに従って設計されたプログラムとの毛細血管を引っ張ります。 注：キャピラリーは数マイクロメートル、直径で終了すると、APPLによって100μmの液滴を形成する必要があります〜10キロパスカルで圧力をYING。キャピラリの先端が、非常に高い圧力、&gt; 600 kPaで小さすぎる場合は、大きすぎるキャピラリ先端で液滴のサイズを制御することは困難であるが、液滴を得るために必要とされます。 </li></ol></li><li>液滴表面へのリン脂質の吸収 注：液滴の湾曲した界面でのリン脂質単分子層を形成するために、染料なしのリン脂質溶液は、リン脂質をタグ付け強度コントラストを得るために使用される、平坦な単層に対して、また、手順1で調製手順2.2.1及び2.2の両方0.2は、ここで許容されています。液滴表面での面圧の精密な制御が必要な場合は、手順2.2.2を強くお勧めします。しかし、そうでない場合は、手順2.2.2よりもはるかに簡単な方法である手続き2.2.1は、便利です。 <ol><li>先端のリン脂質の塗布工程<ol><li>少なくとも3倍、アセトン、エタノール、および脱イオン水を使用したスライドガラスを清掃してください。 </li><li> PL洗浄スライドガラス上のテーパーキャピラリをエース、および先端をスライドガラスに触れ容易にするために、毛細血管を傾けます。 </li><li>ガラスシリンジを使用してスライドガラスに接着され、キャピラリの先端にリン脂質溶液（1mg / ml）の数滴を落とし、そして溶媒を完全に蒸発させるために少なくとも30分待ちます。 注意：先端の周囲のみが毛細管力によって先端部にリン脂質の液滴を保持するには小さすぎるので、それは非常に手続き2.2.1.3中にガラススライドにキャピラリの先端を接着することをお勧めします。 </li></ol></li><li>ベシクル溶液の調製<ol><li>バイアルを清掃して、手順1.1.1.1で導入されたように、バイアルから水を除去します。 </li><li>穏やかに窒素ガスを適用することにより、リン脂質溶液（1mg / ml）2mlの体積を乾燥し、残りの溶媒を除去するために室温で1時間、バイアルを乾燥させます。安全のためにヒュームフード内でこの手順を実行します。 </li><li> 2を追加乾燥した脂質を含有するバイアルに、脱イオン水のmlであり、1時間60℃のオーブン中でバイアルをインキュベートします。 </li><li>小胞を得るために30分間（370 W：40 kHzの、電源までのHF周波数）、および超音波処理バイアルを数回振ります。 </li><li>単分散単層小胞を得るために、押出及び凍結融解処理を実行します。小胞を調製するための詳細なプロトコールは、メイヤーらに記載されている。21。 注：液滴界面の面圧が単分散の単層小胞を含んでいる小滴を形成した後に待機時間を調整することにより正確に制御されます。ペンダントドロップ法22を用いて、前の実験を行うには、時間に応じて面圧の変化を測定する必要があります。 </li></ol></li></ol></li><li>曲面でのリン脂質単分子層を含んでいる小滴の形成<ol><li> procedurからの脱イオン水10μlのテーパーキャピラリーに記入E 2.2.1。また、手順2.2.2からベシクル溶液10μlを使用しています。 </li><li>液滴を形成するための圧力を提供するために、自動化されたマイクロインジェクタにキャピラリを接続します。 </li><li>正確に、キャピラリの位置を制御するマイクロマニピュレーターにマイクロインジェクタに接続されているキャピラリーをマウントします。 </li><li> CCDカメラでキャピラリーの側面図を撮像するための：明視野顕微鏡（10倍NA 0.3顕微鏡1、対物レンズ）を準備します。顕微鏡1は、このようにz軸に沿って液滴の正確な位置を観察し、液滴の大きさを推定することが可能となります。 </li><li>適当な大きさになるまで（〜100、先端部の側面図はよくマイクロマニピュレーターを用いて顕微鏡1によって可視化された位置に先端を移動し、キャピラリーの先端に可変圧力（〜100ヘクトパスカル）を適用液滴の直径がμm）が形成されています。 注：これは、自動化されたマイクロインジェクターやマイクロマニピュレーターが使用することをお勧めしますD、液滴の液滴の大きさと位置の微調整が必​​要な場合。これは手動のものを使用することも可能です。 </li></ol></li></ol>液滴マージ後の3イメージング蛍光回復注意：このプロトコルの基本原理は、液滴合一プロセスを除いて、FRAP技術のものと同一です。 FRAPの詳細なプロトコルおよび関連する理論は、A・ロペスら 15およびDアクセルロッドら 16でご利用いただけます。 <ol><li>液滴の位置を監視し、制御します<ol><li>ローダミンDPPES（560 nmでの励起、583 nmでの発光）のための適切なフィルターセットを蛍光顕微鏡の両方を可能にします（：10×NA 0.3、結像レンズの焦点距離17センチメートル顕微鏡2、対物レンズ）セット倒立顕微鏡を準備そして明視野顕微鏡。蛍光顕微鏡メートルで、液滴の上面図を可視化するために、ここでCCDカメラを使用してくださいODEと明視野顕微鏡モード。 </li><li> z軸に沿ってフラット空気 - 水界面にリン脂質でコーティングされた小滴を移動しますが、マイクロマニピュレーターを使用して、まだ液滴をマージしません。液滴の側面図を可視化する顕微鏡1を使用します。 </li><li>マイクロマニピュレーターを使用して、平らな単層の上面図の中心に小滴の位置を確認します。平らな単層の上面図を可視化するために、顕微鏡2の明視野顕微鏡モードを使用します。 </li></ol></li><li>フラット空気 - 水界面への液滴のマージ<ol><li>液滴がマイクロマニピュレーターを使用して、インターフェイス上にマージされるまで平坦な界面に向けて更なる液滴を移動します。マージ処理が正常に行われた場合、白い背景に囲まれた円形状の暗領域は、顕微鏡2の蛍光モードを用いて観察されます。 </li><li>ミクロスの蛍光モードを使用して、液滴をマージした後、時間による蛍光画像の系列を記録します2.ここでは、単層の拡散時間スケールよりも速いフレームレートを使用して対処します。 DOPC単層では、それは完全に200μmの暗い領域内に拡散するために数分かかります。 </li></ol></li></ol> 4.画像解析によって拡散係数の決定注意：以下に説明するように、一連の画像から拡散係数を決定するために、画像解析用にカスタマイズされたプログラムが組み込まれています。このプログラムの詳細なソースコードは、Joveのウェブサイトで利用可能です。 <ol><li>関心の円形領域の検出<ol><li>関心領域の中心の検出<ol><li>円形暗い領域と白の背景を含むリカバリプロセス中に記録された蛍光画像のシリーズを入手して、基準画像としてシリーズの最初の画像を設定します。ここで、R Dは、参照画像内の暗い領域の半径です。 </li><li>誰白丸で参照画像を畳み込みますSE強度が全領域にわたって均一です。ここでは、カスタマイズプログラム行124のソースコードに示すように、コンボリューションのための「CONV2 &#39;という名前の埋め込 ​​み機能を使用して、白い円の半径はR Dよりもわずかに小さいです。 </li><li>畳み込み演算の最小値を示す位置を検索し、参照画像内の関心領域の中心としてこの位置を設定します。 </li></ol></li><li>関心のある領域の半径を決定します<ol><li>全領域にわたって手順4.1および均一な強度によって決定される中心位置を含み、白丸で参照画像を畳み込みます。ここで、R Sは、白い円の半径です。使用反復ような &#39;の&#39;またはカスタマイズされたプログラム行109から102のソースコードに示すように白丸を作るために円の方程式と「しばらく」など。 </li><li>少し持っている別の白丸で参照画像を畳み込みますR Sよりも大きな半径（5％-10％）であり、R L、。カスタマイズされたプログラム行120から113のソースコードに示すように円を作るための手順4.1.2.1と同様の方法を使用します。 </li><li> 4.1.2.1と4.1.2.2の2畳み込み計算の間の値の差を取得します。 </li><li>ピクセルレベルでR SとR Lの両方を増加させることにより、R、S = 2R Dに R S = R D / 2から上記の手順を繰り返します。繰り返すように4.1.2.3に手順4.1.2.1からの全ソースコードが含まれている反復を行います。 </li><li> 2畳み込み計算の間の値の最大差を示すR Sの半径を検索します。このRは、このように、参照画像内の暗い領域の半径を示し、S 149にカスタマイズしたプログラム行148のソースコードに示すように半径を見つけるために、「最大」という名前を使用し、組み込み関数は、値の最大差を示しています。 </li></ol></LI&gt; </ol></li><li>分数の強度の計算<ol><li>関心領域として手順4.1によって決定中心位置と半径を、含まれている円を設定します。 </li><li>時間に応じて蛍光画像の一連の関心領域の平均強度を計算します。関心のある領域で各フレームを畳み込むと平均強度を計算するために、関心領域の面積で割り。詳細はJoveのウェブサイトで提供されてカスタマイズされたプログラムのソースコードで提供されています。 </li><li>次式のように定義分数強度を計算し、F（t）は時間に応じて関心領域である円内の平均強度であり、F iは円の中に最初の強度であり、F oはの強度であり、白い背景。 F（T）=（F（T） - F I）/（F O - F i）を （式1）。 </li></ol></li><li> FフィッティングFRAP理論にractional強度<ol><li> I 1はフィッティングプログラムを使用して、ベッセル関数を変更され、τは特性拡散時間とI 0である下記式、で端数強度を取り付け、τを得ます <img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/53376/53376eq2.jpg" /> （式2）。 </li><li> Dは拡散係数であり、暗い領域の半径である関係、τに基づいて、拡散係数= 2/4 Dを 、取得します。 注：フィッティングプロセス中に、回復プロセスは、すでに画像を記録する前に、開始されたときに、時間軸に沿って分数強度プロファイルをシフトすることが可能です。 </li></ol></li></ol>

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Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+recovery+after+merging+a+surfactant-covered+droplet:+a+novel+technique+to+measure+the+diffusion+of+phospholipid+monolayers+at+fluid/fluid+interfaces.">Fluorescence recovery after merging a surfactant-covered droplet: a novel technique to measure the diffusion of phospholipid monolayers at fluid/fluid interfaces.</a> Langmuir. 30 (48), 14369-14374 (2014).</li></ol>

The authors declare no competing financial interest.

FRAMは、特に特定の領域を漂白した後蛍光回復を測定するため、FRAPとの基本原則の多くを共有するが、FRAMは、漂白の領域を形成するために平坦な界面上に液滴をマージする代わりに、強い光を適用するプロセスを使用しています。マージ処理は、このようにFRAMの中で最も重要なステップであり、特に、液滴をマージした後のフラット化単分子膜で暗い染みの形状は、拡散率測定の精度を決定します。具体的には、現在の方法に基づいて、我々は唯一の手順4に示した暗い染色の平均強度を計算する関心領域として半径Rの円を設定し、円形状からあまり偏差がある場合、これは、拡散係数の正確な測定を妨げるであろう。したがって、円形の暗領域を得るために必要であるが、非円形の形状が原因で、いくつかの理由のために時折形成されています。まず、ペットにおける対流が存在する場合里皿を、暗い領域の形状は、流れの方向に沿って細長いなります。手順1.3で述べたように、円錐形装置は、対流を抑制するのに役立ち、そしてこの伸びを最小限に抑えることになります。キャピラリの先端がマージプロセス中に平坦な界面に触れるとキャピラリー端がマージ処理を中断するので秒、暗い領域は、様々な形状に形成されています。唯一の毛細管の最後からぶら下がっている液滴を取得することにより、この中断を防止することができます。具体的には、キャピラリーの疎水化処理は、キャピラリの最後に座って液滴をするのに役立ちます。したがって、上記のトラブル銃撃や修正をより正確に拡散特性を測定することが可能となります。 このよくtroubleshotプロセスは、このようにFRAMは、FRAPの上にいくつかの重要な利点を持つことができます。まず、FRAMは、FRAPに比べて簡単な装置を必要とします。 FRAMのために、簡単な蛍光MICROSを使用するのに十分です代わりに波長色素の吸収スペクトルと一致している必要があり、高出力レーザーで高価な共焦点顕微鏡で、対応いたします。また、FRAMは、液滴サイズ、液滴表面の面圧を調整することにより、容易に領域のサイズを制御しながら、FRAPで漂白領域の大きさを調整するために追加の装置を使用する必要があります。第二に、FRAM中の染料の様々な種を使用することが可能です。 FRAPは、その漂白プロセス、拡散プロセスよりもはるかに高速である色素分子を使用しています。染料の拡散が漂白工程中に発生した場合、それは正確に拡散特性を推定することは困難です。 FRAMは、しかしながら、染料を漂白するための方法を必要とせず、これは、このように蛍光イメージングにおける染料の様々なタイプの使用を可能にします。また、FRAPは、追加の高出力レーザーを必要とするフィルタは、FRAMにフィルタセットを交換することだけが必要であるが、染料の種類を変更する設定します。最後に、FRAPのみを測定しながら、液滴表面と平坦な界面で単分子層は、このように相互拡散の調査を可能にする、またはB型の単層に型単層をマージすることによって、2つの異なる脂質単層との混合、独立して形成することができるので単分子層の自己拡散。 これらの利点にもかかわらず、フラットな空気 - 水界面上に液滴をマージするプロセスは、潜在的に、このような2単層との間の面圧の不一致などの懸念があるかもしれないいくつかの問題に起因するこの技術では、マージ処理の時間スケールを制限することができます、および液滴をマージした後平らな単分子膜の表面圧の増加。これらの問題は、しかし、次の理由により、大幅に拡散測定には影響を与えません。まず、二つの異なる単層における面圧が非常に異なっていても、平衡化プロセスは、回復プロセスの間、非常に早い段階で終了します。例えば、T彼は、液滴表面に単分子膜の面圧が平坦な空気 - 水界面で単分子層よりも高い、暗い領域は、表面圧平衡になるまで膨張します。このプロセスは、10ミリ秒以内に完了しているので、それはかなり拡散プロセスに影響を与える前に、面圧が平衡化されます。マージ処理の時間スケールが十分に高速であれば第二に、それは全く拡散測定を制限するものではありません。幸いなことに、典型的なマージプロセスは、10ミリ秒以内に完了されます。トラフの表面積は、液滴の表面積よりもはるかに大きいため、最終的に、平坦な界面に液滴の偶数倍マージは、表面圧を増加させません。トラフのサイズおよびプロトコルに記載の液滴によると、分子当たりの面積は、液滴をマージして0.015％未満を増加させます。従って、原因分子当たりの面積の変化に対する面圧の上昇がnegligiblで0.1％未満でありますEウィルヘルミー板張力計によって測定され、それは、面圧で、典型的な誤差よりはるかに小さいからです。 要約すると、我々は平坦な界面上に液滴単層をマージすることにより、リン脂質単層の横方向の拡散特性を測定するための新しい方法を導入しました。この技術は、比較的単純な設備を必要とし、また色素種の各種の使用を可能にします。 FRAMは、流体 - 流体界面でのリン脂質、ブロックコポリマー、タンパク質、さらにはナノ粒子を含む任意の表面活性剤の拡散を測定するためにこのように潜在的に適用可能です。さらに、我々はFRAMは、2つの異なる界面活性剤との間の相互拡散や混合を研究する新しい方法を提供することを期待しています。

<html>リン脂質は細胞膜および細胞小器官の膜の主要成分であり、これらの膜層の流動性は、多くの場合、膜タンパク質1の活性を変化させることによって細胞機能に影響する- 3。例えば、膜&#160;脂質ホメオスタシスは、膜タンパク質によって検出される膜の流動性を調整することによって達成され、流動性の異常なレベルは、脂肪肝及び胆汁うっ滞4などの重篤な疾患を引き起こします。また、エア肺胞流体界面でのリン脂質単分子膜の流動性は、その機能において重要な意味を持ちます。低流動性が呼気5,6の間に肺胞内に収まるように層を可能にする一方、肺サーファクタントリン脂質単層の高い流動性は、吸入の間層の広がりを促進します。これは、それらの役割を理解するために、リン脂質層​​の流動性を推定することが重要です。 _content &quot;&gt;流動性の直接測定は、粘度であり、かつリン脂質層の粘度は、ミクロンサイズのコロイド7、磁性針8,9、および磁性マイクロボタン6,10,11を用いて測定された。しかしながら、これらの技術比較的剛性のフィルムに限定され、かつ粘性の低いフィルムを測定することができない。このような場合、拡散率はリン脂質層​​の流動性を定量化するための代替手段であろう。数十年のために、リン脂質層​​の拡散特性を測定するための様々な技術が開発されていますこのような蛍光消光法12、パルス磁場勾配NMR 13、および蛍光相関分光法（FCS）14として最も代表的な方法の一つは、（FRAP）15,16を光退色後蛍光回復である。これにより、測定手順の単純さと関連しますリン脂質層​​の拡散特性の理論、いくつかの研究では、FRAPを使用して行われてきました<suP&gt; 17から19まで。しかし、FRAPは、通常、高出力レーザーで高価な共焦点顕微鏡のセットアップが必要です。 ここでは、（FRAM）をマージした後蛍光回復と呼ぶリン脂質単層の横方向の拡散を測定するための新しい手法を提示します。 FRAPとFRAMの主な違いは、光退色のステップをドロップ合体により置換されていることです。蛍光標識された平らな単層上に非蛍光単分子膜で覆われた液滴をマージするので、光退色のステップと同じ初期状態を設定し、明るいフラット化単分子膜上に円形の暗い染みを残します。それから、横方向の拡散率を測定するための時間と暗い染色での蛍光回復を観察します。ドロップ合体によるこの新しい「漂白」のステップは、FRAP上で重要な利点を提供します：FRAMは、蛍光顕微鏡ではなく、FRAPに必要な高出力レーザで高価な共焦点顕微鏡を必要とします。私n個の追加、それが光退色過程を伴わないため、FRAMは、蛍光色素の幅広い選択をしています。 FRAPのみが単層の自己拡散を測定しながら、最終的に、二つの異なる単層、液滴単層および平坦化単分子膜は、このように相互拡散を測定することができるように、独立して調製することができます。 FRAMは、高粘性の物質からほぼ非粘性材料に拡散測定の広い範囲を提供します。原則として、FRAMは、拡散がドロップ合体プロセス（〜10ミリ秒）の時間の間に100ミクロンによって領域にわたって100μmで発生した場合、既存の技術に匹敵する10 6μmの2 /秒、最大拡散率を測定することができます。単層が固体でない限り、また、遅い拡散プロセスを容易に測定することができます。 FRAMであれば、適切な蛍光タグ付き分子が利用可能であるような表面活性物質、任意の種類のために使用することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1288">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Acetone</td>
			<td style="width:269px;">OCI corporation</td>
			<td style="width:251px;">Acetone 3.8L Extra Pure</td>
			<td style="width:552px;">Purity: &#8805; 99.5%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Ethanol</td>
			<td>OCI corporation</td>
			<td>Ethanol 3.8L Extra Pure</td>
			<td>Purity: &#8805; 94%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Deionized water/Water purify system</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q liocel</td>
			<td>&#62;18.2 M&#937;&#903;cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dioleoylphosphatidylcholine, DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375C</td>
			<td>Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Chloroform is carcinogenic.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Chloroform</td>
			<td>LiChrosolv</td>
			<td>Chloroform ultrapure (A3633)</td>
			<td>Purity: &#8805; 99.8%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodamine DPPE</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810158C, 810158P</td>
			<td>Avoid direct light exposure to prevent photobleaching</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wilhelmy plate tensiometer</td>
			<td>R&#38;K ultrathin organic film technology</td>
			<td>Wilhelmy tensiometer</td>
			<td>http://www.rieglerkirstein.de/index.htm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette puller</td>
			<td>Sutter instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro-injector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Femtojet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Micromanipulator 5171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope 1</td>
			<td>Objective lens: Olympus</td>
			<td>Objective lens: UPlanFl 10x</td>
			<td>Objective lens: 10x NA 0.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope 2</td>
			<td>Objective lens: Olympus, Tube lens: Thorlabs</td>
			<td>Objective lens: UPlanFl 10x</td>
			<td>Objective lens: 10x NA 0.3, tube lens: focal length 17 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CCD for Microscope 1</td>
			<td>Jai</td>
			<td>CV 950 camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CCD for Microscope 2</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon3 EMCCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter set</td>
			<td>Chroma technology</td>
			<td>Catalog Set 49004: ET545, T565, ET605</td>
			<td>Prepare suitable for dye molecules</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sonicator</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>Wiseclean WUC-D06H</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence recovery after merging a droplet to measure the two-dimensional diffusion of a phospholipid monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

図1に記載されている蛍光画像のシリーズは、フラットDOPC単層上DOPC単層で被覆された小滴を併合した後、リカバリ処理時間で得られた。平らな空気-水界面におけるDOPC単層を少量ドープしましたローダミンDPPE、これは、このようにそれが可能な新たに平坦な界面に追加明るい色と暗い領域と背景を可視化するために作られました。そこでは、回復プロセスは、23 MN /固定面圧のMで観察されました。時間に応じて分数強度の変化に式（1）の適合は、図2に示されている。このフィットのR 2値は0.999であり、このフィットは、依然としてより低いまたはより高い表面圧力でうまく機能します。このフィットから得られたDOPC単層の拡散係数は、表面圧は23mN / mで27.54ミクロン2 /秒でした。 FRAMのさらなる検証、DOの拡散係数についてPC及びジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）の単層は、表面圧に従って測定しました。 LE（液体が膨張）相転移が10を発生し、値- 図3に示すように 、FRAMは、LC（液体凝縮）面圧の〜9 MN / mにおけるDPPC単層の拡散係数の急激な低下を捕捉拡散係数はまた、ピーターズらによって以前に測定値とよく一致している。19。また、面圧で拡散係数の指数関数的減衰は、DOPC単層で観察されたが、この傾向はカルーソら 12により測定したものとほぼ同じです。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig1.jpg" /> 図1（A）FRAMの模式図（マージした後蛍光回復）技術。リップとしてIDの単層コーティングされた液滴が平らな空気 - 水界面にマージされ、蛍光のない脂質単層は、脂質は、フラット蛍光脂質単層内に挿入されるタグを付けました。表面圧は23mN / mで（スケールバー= 100ミクロン）でDOPC単層の回復プロセス中の時間と（B）の蛍光顕微鏡画像。 DOPC単層の暗い領域は完全に数分以内に、拡散プロセスによって回収される。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53376/53376fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig2.jpg" /> 時間対2フラクショナル強度図 。黒丸とグレーの点線は、時間の経過とともに、分別強度に画像解析（手順4.1および4.2）と式1のフィットから得られた端数強度の値を示しますそれぞれ、手順4.3に示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53376/53376fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig3.jpg" /> DOPC（三角形）とDPPC（空の角）面圧の関数として単層の図3.拡散係数。明るいグレー色のダークグレー色のラインが以前ピーターズらによって報告された拡散係数の値を示しています。そして、カルーソら 、それぞれ。この図は、チョンら 23から変更されています。チョンらラングミュア 。30（48）、14369から14374の許可を得て転載。著作権2014年米国化学会。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53376/53376fig3large.jpg" target="_blank">彼女をクリックしてください</a>この図の拡大版を表示するには、E。

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Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

リン脂質単層の二次元拡散を測定するためにドロップレットをマージした後蛍光回復

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.0K ビュー.  KAIST. We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

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Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

タンパク質、細胞閉じ込めのための二次元加工基板を作成する

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

生物工学

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

のための周期的圧力のバイオリアクターの設計生体外で</em大動脈心臓弁の>研究

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

マイクロ流体液滴のプラットフォームのための蛍光検出法

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently incorporated into film assemblies that serve as adsorption platforms for protein monolayer electrochemistry (PME). PME is utilized as the model system for studying electrochemical properties of redox proteins by confining them to an adsorption platform at a modified electrode, which also serves as a redox partner for electron transfer (ET) reactions. Studies have shown that gold nanoparticle film assemblies of this nature provide for a more homogeneous protein adsorption environment and promote ET without distance dependence compared to the more traditional systems modified with alkanethiol self-assembled monolayers (SAM).1-3 In this paper, MPCs functionalized with hexanethiolate ligands are synthesized using a modified Brust reaction4 and characterized with ultraviolet visible (UV-Vis) spectroscopy, transmission electron microscopy (TEM), and proton (1H) nuclear magnetic resonance (NMR). MPC films are assembled on SAM modified gold electrode interfaces by using a "dip cycle" method of alternating MPC layers and dithiol linking molecules. Film growth at gold electrode is tracked electrochemically by measuring changes to the double layer charging current of the system. Analogous films assembled on silane modified glass slides allow for optical monitoring of film growth and cross-sectional TEM analysis provides an estimated film thickness. During film assembly, manipulation of the MPC ligand protection as well as the interparticle linkage mechanism allow for networked films, that are readily adaptable, to interface with redox protein having different adsorption mechanism. For example, Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) can be adsorbed hydrophobically to dithiol-linked films of hexanethiolate MPCs and cytochrome c (cyt c) can be immobilized electrostatically at a carboxylic acid modified MPC interfacial layer. In this report, we focus on the film protocol for the AZ system exclusively. Investigations involving the adsorption of proteins on MPC modified synthetic platforms could further the understanding of interactions between biomolecules and man-made materials, and consequently aid the development of biosensor schemes, ET modeling systems, and synthetic biocompatible materials.5-8

Alkanethiolate stabilized gold colloids known as monolayer protected clusters (MPCs) are synthesized, characterized, and assembled into thin films as an adsorption interface for protein monolayer electrochemistry of simple redox protein like Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) and cytochrome c (cyt c).

合成、組立、および単分子膜のキャラクタリゼーションは、タンパク質単分子層の電気化学のための金ナノ粒子膜を保護

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

細胞内小胞の追跡への応用：変形二光子顕微鏡での3d軌道の追跡

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

商業顕微鏡でのライブ細胞膜上の分子拡散法への高速蛍光イメージングから

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic macrocycles that exhibit differential cytostatic and cytotoxic properties in specific cell lines, depending on the identities of the chelated metal and functional groups. The unique behavior of functionalized corroles towards specific cell lines introduces the possibility of targeted chemotherapy.
Many anticancer drugs are evaluated by their ability to inhibit RNA transcription. Here we present a step-by-step protocol for RNA transcription in the presence of known and potential inhibitors. The evaluation of the RNA products of the transcription reaction by gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy provides information on inhibitive properties of potential anticancer drug candidates and, with modifications to the assay, more about their mechanism of action.
Little is known about the molecular mechanism of action of corrole cytotoxicity. In this experiment, we consider two corrole compounds: gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (Ga(tpfc)) and freebase analogue 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (tpfc). An RNA transcription assay was used to examine the inhibitive properties of the corroles. Five transcription reactions were prepared: DNA treated with Actinomycin D, triptolide, Ga(tpfc), tpfc at a [complex]:[template DNA base] ratio of 0.01, respectively, and an untreated control.
The transcription reactions were analyzed after 4 hr using agarose gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy. There is clear inhibition by Ga(tpfc), Actinomycin D, and triptolide.
This RNA transcription assay can be modified to provide more mechanistic detail by varying the concentrations of the anticancer complex, DNA, or polymerase enzyme, or by incubating the DNA or polymerase with the complexes prior to RNA transcription; these modifications would differentiate between an inhibition mechanism involving the DNA or the enzyme. Adding the complex after RNA transcription can be used to test whether the complexes degrade or hydrolyze the RNA. This assay can also be used to study additional anticancer candidates.

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole and its freebase analogue exhibit low micromolar cell cytotoxicity. This manuscript describes an RNA transcription reaction, imaging RNA with an ethidium bromide-stained gel, and quantifying RNA with UV-Vis spectroscopy, in order to assess transcription inhibition by corroles and demonstrates a straightforward method of evaluating anticancer candidate properties.

アン<em&gt;インビトロ</em&gt;酵素アッセイは、ガリウム（III）とHによる転写阻害を測定する<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15トリス（ペンタフルオロフェニル）corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

3Dコラーゲンマトリックス中の走化性を調査するために、平面グラデーション拡散システム

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

光ファイバを用いて、液滴マイクロフルイディクスのための多色蛍光検出

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Merging Ion Concentration Polarization between Juxtaposed Ion Exchange Membranes to Block the Propagation of the Polarization Zone

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP induces a noninvasive region for charged biomolecules (i.e., the ion depletion zone), and targets can be preconcentrated on this region boundary. Despite the high preconcentration performances with ICP, it is difficult to find the operating conditions of non-propagating ion depletion zones. To overcome this narrow operating window, we recently developed a new platform for spatiotemporally fixed preconcentration. Unlike preceding methods that only use ion depletion, this platform also uses the opposite polarity of the ICP (i.e., ion enrichment) to stop the propagation of the ion depletion zone. By confronting the enrichment zone with the depletion zone, the two zones merge together and stop. In this paper, we describe a detailed experimental protocol to build this spatiotemporally defined ICP platform and characterize the preconcentration dynamics of the new platform by comparing them with those of the conventional device. Qualitative ion concentration profiles and current-time responses successfully capture the different dynamics between the merged ICP and the stand-alone ICP. In contrast to the conventional one that can fix the preconcentration location at only ~5 V, the new platform can produce a target-condensed plug at a specific location in the broad ranges of operating conditions: voltage (0.5-100 V), ionic strength (1-100 mM), and pH (3.7-10.3).

The protocol for a novel ion concentration polarization (ICP) platform that can stop the propagation of the ICP zone, regardless of the operating conditions is described. This unique ability of the platform lies in the use of merging ion depletion and enrichment, which are two polarities of the ICP phenomenon.

偏光ゾーンの伝播を遮断するように並置されたイオン交換膜との間のイオン濃度分極のマージ

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP ...