このプロトコルは、非筋肉筋筋のダイナミクスをタンパク質レベルで特徴付けるために使用することができ、細胞内での役割に寄与する運動特性を知らせることができる。これは、様々な調節条件がミオシン運動に及ぼす影響を研究し、細胞行動を知らせる高速で再現性の高い高度に制御された方法です。これらの技術は、非筋肉ミオシンの疾患を引き起こす突然変異が単一分子およびアンサンブルレベルでの行動にどのような影響を与えるかを調べるのに使用することができる。
その方法論の一般的なアプローチは、微小管を用いた精製キネシンおよびダイニンの特性化など、他の様々な細胞骨格系に適用することができる。このプロトコルの汎用性は、どの蛍光器と化学条件が最も適切であるかについての疑問を提起することができますが、方法は比較的迅速に最適化することができます。フローチャンバーの設置方法とコーティング方法を理解することで、これらの実験のさまざまな条件に適応できる強力な基礎となります。
まず、アセテートアミルにニトロセルロース溶液を1%用意し、組織培養プレートの底部に直径125ミリメートルの円形のろ紙を置きます。8つの正方形のカバースリップをラックに積み込み、約2〜5ミリリットルの200プルーフエタノールで十分に洗浄し、続いて蒸留水を2〜5ミリリットルで洗浄します。その後、フィルターエアラインまたは窒素ラインを使用してカバースリップを完全に駆動します。
1つのカバースリップの1つの端に沿って1パーセントのニトロセルロース溶液のゆっくりとピペット10マイクロリットル。1つの滑らかな動きで200マイクロリットルのピペットの先端の側面を使用してカバースリップの残りの部分にそれを塗りつぶす。次に、ニトロセルロース側を上にして、このカバースリップを組織培養皿の上に置きます。
残りのカバースリップに対してこれを繰り返し、乾燥させます。光学レンズ紙で顕微鏡スライドを拭き取り、大きな破片を取り除きます。両面テープを2枚、長さ約2センチメートル切り、顕微鏡スライドの長い端の中央に沿って1枚を置きます。
テープの2番目の部分は、2枚が平行になるようにテープの最初の部分の下に約2ミリメートルを置き、約10マイクロリットルの溶液を保持できる流れチャンバを作成します。ニトロセルロースカバーのスリップの1つをテープに慎重に貼り付け、ニトロセルロースでコーティングされた側がテープに直接接触するようにします。ピペットチップを使用して、スライドテープインターフェースを軽く押し下げて、カバースリップがスライドに正しく付着していることを確認します。
その後、かみそりの刃でスライドの端にぶら下がっている余分なテープをカットします。ミオシン5aの溶液を準備し、氷の上に保管してください。ミオシン5aの10マイクロリットルの流れはスライド流チャンバーを通り、1分間待つ。
その後、DTTと運動バッファーでミリリットルBSAあたり1ミリグラムの10マイクロリットルで流れます。これを2回繰り返し、3回目の洗浄の後に1分待ちます。ティッシュペーパーまたはフィルターペーパーのコーナーを使用して、流れチャンバー出口に紙の角をそっと置くことによって、流路を通して溶液を芯に入れます。
その後、DTTで運動バッファーの10マイクロリットルで洗浄します。1ミリリットルのシリンジと27ゲージの針を使用した黒いアクチン溶液をピペットし、その溶液をチャンバーに導入する前にアクチンフィラメントを剪断します。1ミリモルDTTで50ミリモルMBの1ミリモルATPの存在下でチャンバーに黒いアクチンを追加します。
次に、DTTと1ミリモルATPを用いた運動バッファーの50マイクロリットルで流れ、フリーアクチンフィラメントのチャンバーを枯渇させた。10マイクロリットルの運動バッファーをDTTで3回洗浄し、任意のATPのチャンバーを枯渇します。DTTを有する運動性バッファーを含む20ナノモルRHアクチン溶液の10マイクロリットル内の流れ、カバースリップの表面に付着したミオシン5aへのアクチンフィラメントの厳格な結合を可能にする1分間待つ。
DTTで10ミリモル運動バッファーの10マイクロリットルで洗浄し、非結合RHアクチンフィラメントを除去します。最終バッファーの30マイクロリットルで流れる。561ナノメートルの励起波長を用いて蛍光顕微鏡で画像を記録し、RHアクチンを可視化します。
ミオシン5a反転運動アッセイの溶液を準備し、氷の上に保管してください。DTTで10マイクロリットルの運動バッファーでチャンバーを洗浄してください。DTTを有する運動バッファーで1ミリグラムBSAあたり1ミリグラムの10マイクロリットルで流れる。
これを2回繰り返し、3回目の洗浄の1分後に待ちます。流れチャンバ出口に紙の角をそっと置くことによって、流路を通して溶液を芯にするティッシュまたはフィルターペーパーを使用してください。その後、DTTで10マイクロリットルの運動バッファーでチャンバーを3回洗浄します。
ニュートラアビジン溶液の10マイクロリットルの流れをDTTで運動バッファーに入れ、1分間待ちます。その後、その溶液の10マイクロリットルで3回洗浄します。大退屈なピペットチップを用いたDTTによる運動性バッファーを含むBRHアクチンの10マイクロリットルの流れ。
そして1分間待ちます。その後、10マイクロリットルの運動バッファーをDTTで3回洗浄します。10ナノモルミオシン5aを有する最終バッファーの30マイクロリットルの流れ。
そして、すぐに全内部反射の蛍光顕微鏡に荷を積む。TIRFイメージングに最適なフォーカスが見つかったら、記録を開始します。非筋ミオシン2bの精製は、必須の軽鎖、及び調節性軽鎖、ならびにミオシン5a及びカルモジュリンをSDS-PAGEを行うことにより評価した。
グライダーアクチンフィラメントアッセイは、ラベル付きアクチンフィラメントの滑らかな動きを特徴とする理想的で追跡可能な映画の特徴を示しています。黒いアクチン洗浄により、死んだミオシンヘッドが測定フィールドから取り除かれ、アクチンフィラメントの全体的な滑らかな動きにさらに寄与することが保証されました。フィラメント追跡出力画像は、非筋肉ミオシン2bおよびミオシン5aに対して高速トラックプログラムから得られた。
代表的なヒストグラムは、アクトミオシン2b滑空速度が毎秒77ナノメートルであることを示しています。そして、アトミオシン5aのそれは515ナノメートル/秒です。メチルセルロースがない場合、アクチンフィラメントはミオシンコーティングされた表面によって密接に関連付けが残らず、非筋肉ミオシン2bコーティングカバースリップの表面に近いフロッピングを引き起こす。
ミオシンの動きは、反転運動アッセイを用いて表面につながれた蛍光アクチンフィラメントで観察された。黒いアクチン洗浄用のフローセルに導入する前に、ラベルなしのアクチンを剪断することが重要であり、アクチンの転位をスムーズに行うことが可能です。その他の実験では、ミオシンの運動性がミオシン突然変異、負荷誘導タンパク質、イオン強度、および調節タンパク質によってどのように影響を受けるかを調べることができます。
様々な細胞条件は、将来の研究のために再構成することができます.これらの方法は、様々なミオシンアイソフォームが単一分子およびアンサンブルレベルでのそれらの運動性および機械的特性においてどのように変化するかを生化学的および生物物理学的に調査することを可能にする。
