このプロトコルのユニークな価値は、小さなラボスペースですぐに利用できる機器を使用する2人の担当者が、50エーカーの運用SITプログラムをサポートするのに十分な無菌の悪蚊を生産できることです。この技術の効率と低コストにより、小規模な蚊駆除地区でさえ、統合されたベクター制御プログラムを強化することがアクセス可能で扱いにくくなります。手順を実演するのは、私と研究ユニットの生物科学検査技師であるバーバラ・ベイヤーです。
蛹から成虫のネッタイシマカを飼育するには、0.84 x 0.84ミリメートルの穴サイズのグラスファイバーメッシュスクリーニングを備えた60 x 60 x 60センチメートルの折りたたみ式アルミニウム飼育ケージと、各ケージの1つの垂直壁にリーチインストッキネットスリーブを準備します。ネッタイシマカが入った1, 900ミリリットルのプラスチックカップを各飼育ケージに1対1の性比で置き、スリーブを閉じて、カップをケージに入れて閉じます12:12または14:10の明暗サイクルで、相対湿度50%を超える摂氏28〜30度で約4日間、大人が出てこなくなるまで。飼育ケージに蛹を入れてから24時間後、スポンジ芯を入れた10%ショ糖溶液の容器を各ケージに入れ、蜂蜜に浸した10 x 2センチメートルのスポンジをワイヤーフックから吊るして、成虫の蚊にそれぞれ水分補給と栄養を与えます。
その後3〜4週間、ほとんどの成人が2〜3日ごとに出現してから48〜72時間後、1つのラムスキンコンドームにケージあたり50〜100ミリリットルの除繊牛血液を入れ、温水浴でコンドームを摂氏約37度に温めます。タオルでコンドームを丁寧に叩いた後、部分的に乾燥させたコンドームをケージ内の紙で裏打ちされた個々のペトリ皿に30〜60分間入れます。各採血の48〜72時間後に、800ミリリットルの濾過された蛹水を含む1, 900ミリリットルの産卵カップを置き、カップの内周に沿って各ケージに平らに取り付けられた8〜10 x 30センチメートルの種子発芽紙シートを装着する。
ネッタイシマカの幼虫を卵から育てるには、5, 000〜10, 000個の卵が存在する産卵紙を使用し、産卵線に垂直に3〜7センチメートルの断面を切り取ります。水道水と粉砕した魚の餌フレークを半分満たした新しい460ミリリットルの容器にピースを入れます。容器を覆い、少なくとも1分間激しく攪拌してから、内容物全体を3リットルの水道水と50ミリリットルの茶色のスラリーが入った幼虫飼育鍋に注ぎます。
鍋に開始日、ひずみ情報、給餌スケジュールをマークします。幼虫の幼虫のおおよその閾値の割合に達したら、各鍋の内容物をサイズ20〜40のふるいに注ぎ、水道水の絞りボトルを使用して、ふるいから蛹と幼虫を3リットルの目盛り付きプラスチックビーカーに洗い流します。雄の蛹を幼虫と雌の蛹から分離するには、各ビーカーの内容物を複数の1.9リットルのプラスチック容器に分割し、蛹分離器の基部の水門の下に硬くて浅い4リットルの収集容器を置きます。
水道水で約4分の3の3リットルの目盛り付きプラスチックビーカー2つを満たし、上部と下部のノブを調整しながら、セパレーターのガラス板の間のスペースに水を注ぎ、水がセパレーターを連続的に流れるようにします。プレートの根元から約1.25センチメートルの高さで水が均等に溜まったら、セパレーターの下部ノブの開始位置にテープで印を付け、開始位置から1〜2センチメートル反時計回りに下部ノブを連続的に回転させながら、蛹と幼虫の容器をセパレーターに注ぎ始めます。幼虫のほとんどまたはすべてが水門を通って収集容器に洗い流されたら、水流を一時停止し、30番のふるいを使用して幼虫の収集容器を取り除きます。
すべての幼虫が取り除かれたら、水を注ぎ、ノブを再度調整して、オスの蛹が収集容器に洗い流されるようにします。次に、容器からオスの蛹を20番のふるいに注ぎ、水道水の1リットルのスクイーズボトルを使用して、ふるいから別の1.9リットルの容器に蛹を洗います。すべてのオスの蛹が集められたら、水を注ぎ、メスの蛹が収集されるようにノブを調整します。
20番のふるいを使用して、今示したように、雌の蛹を新しい1.9リットルの容器に移します。次に、水を注ぎ、未熟な蚊がすべてセパレーターから洗い流されるまで、ノブを再度調整します。集めたオスの蛹をふるいで濾し、できるだけ少ない水で1リットルの目盛り付きビーカーにうんちを洗います。
湿ったろ紙で裏打ちされたペトリ皿に蛹を単層で慎重に注ぎます。作業中の蛹の動きを防ぐために、新鮮な3ミリリットルの牧草地ピペットを使用してペトリ皿の底から立っている水を取り除きます。ペトリ皿とスタックを束ねてから、照射チャンバーに収まるようにラベルの付いた3.8リットルの再封可能なバッグの中に密封します。
照射された成体の雄の蚊の定量化されたバッチをマークするには、飼育ケージから栄養源をすべて取り除き、1つのケージを大きな二酸化炭素チャンバーに5〜7分間置き、コンテナの側面をノックして壁にしがみついている蚊を取り除きます。暴露期間の終わりに、蚊を吸引器バイアルに移し、蚊を再び麻酔してから、蚊を白い紙で覆われた作業面に振とうします。作業面からすべてのオスを新しいバイアルに慎重に吸引し、すべての成人オスがすべての飼育ケージから収集されるまで、露出と収集を繰り返します。
性別選別プロセス中のある時点で、25匹の成体雄蚊のみを含むバイアルを生成する。すべてのオスが集められたら、風袋を塗った計量ボートで蚊の各卑劣な体重を量り、計量した蚊を50ミリグラムのマーキング染料を含む240ミリリットルのカードストック容器にすばやく注ぎます。すべての蚊が軽くコーティングされるまで、容器を時計回りと反時計回りに1回転させて回転させ、蚊を新しい計量ボートに注ぎ、次に計量ボートを半分に折りたたんで、蚊をストッキネットスリーブからリリースコンテナに流します。
約2グラムのオスの蚊が放出容器に追加されたら、ストッキネットスリーブを閉じ、放出容器のベゼルのラベルテープに染料の色、容器番号、および蚊の総重量をマークします。この代表的なオスの成体ネッタイシマカの飼育、照射、およびマーケティング実験では、3つの飼育ケージから2グラムのオスの成虫蚊を採取し、2つのケージから25匹のオスのバイアルとともに、蚊あたりの平均体重を計算することができました。2つのバッチから合計25匹の雌が廃棄された。
幼虫の飼育週のタイムリーで観察的な給餌は、分離のためのよく発達した蛹を生成するために重要です。これにより、男性と女性が明確に区別され、マーキングステップでの女性の発生が少なくなります。これらの不妊オスは、運用SITプログラムで使用するだけでなく、野生の非照射オスと比較して、交配競争、生存、および照射されたオスの分散を調査する実験にも広く使用できます。
雌の蚊を含むように技術を変更することで、照射された雌の意図しない放出が繁殖力とベクター能力に与える影響を調査することができます。
