이 프로토콜의 고유한 가치는 소규모 실험실 공간에서 쉽게 구할 수 있는 장비를 사용하는 두 명의 직원이 50에이커의 운영 SIT 프로그램을 지원하기에 충분한 멸균 악성 모기를 생산할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 효율성과 저렴한 비용으로 인해 작은 모기 방제 구역에서도 통합 벡터 제어 프로그램을 보강 할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 저와 바바라 바이엘, 연구 단위의 생물 과학 실험실 기술자가 될 것입니다.
번데기에서 성인 Aedes aegypti를 키우려면 0.84 x 0.84mm 구멍 크기의 유리 섬유 메쉬 스크리닝과 각 케이지의 수직 벽에 도달 할 수있는 스토키 네트 슬리브가있는 60 x 60 x 60 x 60 센티미터 접을 수있는 알루미늄 사육 케이지를 준비하십시오. Aedes aegypti 번데기가 든 1, 900 밀리리터 플라스틱 컵을 각 사육 케이지에 1 대 1 성비로 놓고 소매를 묶어 케이지에 넣어 12:12 또는 14:10 빛 : 어두운주기로 섭씨 28-30도 이상의 섭씨 50 % 이상의 온도에서 더 이상 성인이 나오지 않을 때까지 컵을 폐쇄합니다. 번데기를 사육 케이지에 넣은 후 24 시간 후, 스폰지 심지가있는 10 % 자당 용액 용기를 각 케이지에 넣고 철사 고리에서 꿀에 담근 10 x 2cm 스폰지를 매달아 성인 모기에게 각각 수분과 영양을 공급합니다.
대부분의 성인이 출현 한 후 48-72 시간 후에 다음 3-4 주 동안 2-3 일마다 양가죽 콘돔 1 개에 케이지 당 50-100 밀리리터의 소의 혈액을 채우고 뜨거운 물 욕조에서 콘돔을 섭씨 약 37도까지 따뜻하게합니다. 수건으로 콘돔을 조심스럽게 두드린 후 부분적으로 건조 된 콘돔을 케이지 내부의 개별 종이가 늘어선 페트리 접시에 30-60 분 동안 놓습니다. 각 혈액 공급 후 48 내지 72 시간에, 800 밀리리터의 여과 된 번데기 물을 함유하는 1, 900 밀리리터의 산란 컵을 놓고 컵의 내주를 따라 플러시로 장착 된 종자 발아 용지의 8-10 x 30 센티미터 시트를 각 케이지에 넣는다.
Aedes aegypti 유충을 알에서 키우려면 5, 000-10, 000 개의 알이있는 산란 종이를 사용하고 산란 선에 수직 인 3-7 센티미터 단면을 자릅니다. 조각을 수돗물과 분쇄 된 생선 음식 플레이크의 꼬집음으로 절반으로 채워진 새로운 460 밀리리터 용기에 넣으십시오. 용기를 덮고 적어도 1 분 동안 격렬하게 저어주는 다음 전체 내용물을 3 리터의 수돗물과 50 밀리리터의 갈색 슬러리가 들어있는 유충 사육 팬에 붓습니다.
시작 날짜, 변형 정보 및 수유 일정으로 팬을 표시하십시오. 유충 팬에 있는 유충의 대략적인 임계값 비율에 도달하면 각 팬의 내용물을 20-40 크기의 체에 붓고 수돗물을 짜서 번데기와 유충을 체에서 3리터 눈금이 매겨진 플라스틱 비커로 씻어냅니다. 수컷 번데기를 유충과 암컷 번데기에서 분리하려면 각 비커의 내용물을 여러 개의 1.9리터 플라스틱 용기로 나누고 번데기 분리기 바닥의 수문 아래에 단단하고 얕은 4리터 수집 용기를 놓습니다.
3리터 눈금이 매겨진 플라스틱 비커 2개를 수돗물로 약 3/4 정도 채우고 분리기의 유리판 사이의 공간을 통해 물을 붓는 동시에 물이 분리기를 통해 계속 흐를 수 있도록 상단 및 하단 손잡이를 조정합니다. 고인 물이 플레이트 바닥에서 약 1.25cm 높이로 고르게 모이면 분리기 하단 손잡이의 시작 위치를 테이프로 표시하고 번데기와 유충 용기를 분리기에 붓고 시작 위치에서 1-2cm 떨어진 시계 반대 방향으로 바닥 손잡이를 계속 돌립니다. 대부분의 또는 모든 유충이 수문을 통해 수집 용기로 씻겨지면 물의 흐름을 멈추고 30 번 체를 사용하여 유충의 수집 용기를 청소하십시오.
모든 유충이 제거되면 물을 붓고 손잡이를 다시 조정하여 수컷 번데기가 수집 용기에 플러시 될 수 있도록합니다. 그런 다음 용기에서 수컷 번데기를 20 번 체에 붓고 1 리터의 수돗물을 사용하여 체에서 번데기를 별도의 1.9 리터 용기로 씻습니다. 수컷 번데기가 모두 모이면 물을 붓고 손잡이를 조정하여 암컷 번데기를 모을 수 있도록 합니다.
숫자 20 체를 사용하여 방금 시연 한대로 암컷 번데기를 새로운 1.9 리터 용기로 옮깁니다. 그런 다음 물을 붓고 미성숙 모기가 분리기에서 모두 배출 될 때까지 손잡이를 다시 조정하십시오. 수집 된 수컷 번데기를 체로 걸러 내고 똥을 가능한 한 적은 물로 1 리터 눈금 비커로 씻으십시오.
번데기를 촉촉한 여과지가 늘어선 페트리 접시에 조심스럽게 붓습니다. 작업 중 번데기 움직임을 방지하기 위해 신선한 3 밀리리터 목초지 피펫을 사용하여 페트리 접시 바닥에서 고인 물을 제거하십시오. 조사 챔버에 맞도록 라벨이 붙은 3.8리터 재밀봉 가능한 백 안에 밀봉하기 전에 페트리 접시와 스택을 묶습니다.
성인 방사선 조사 수컷 모기의 정량화 된 배치를 표시하려면 사육 케이지에서 영양 공급원을 제거하고 케이지 하나를 큰 이산화탄소 챔버에 5-7 분 동안 넣고 용기의 측면을 두드려 벽에 달라 붙는 모기를 제거합니다. 노출 기간이 끝나면 모기를 흡인기 바이알로 옮기고 모기를 다시 마취한 다음 모기를 흰 종이로 덮인 작업 표면에 흔듭니다. 작업대에서 모든 수컷을 새 바이알로 조심스럽게 흡인하고 모든 성인 수컷이 모든 사육 케이지에서 수집 될 때까지 노출과 수집을 반복합니다.
성 분류 과정의 어느 시점에서 25 마리의 성인 수컷 모기 만 들어있는 바이알을 생성합니다. 모든 수컷이 수집되면, 저울에 타르 처리 된 계량 보트에서 모기의 각 사악한 무게를 측정하고 계량 된 모기를 마킹 염료 50 밀리그램이 들어있는 240 밀리리터 마분지 용기에 신속하게 붓습니다. 모든 모기가 가볍게 코팅될 때까지 용기를 시계 방향 및 시계 반대 방향으로 한 바퀴 완전히 기울이고 회전하고 모기를 새 계량 보트에 부은 다음 계량 보트를 반으로 접어 모기가 스토키네트 슬리브를 통해 방출 용기로 전달될 수 있도록 합니다.
약 2g의 수컷 모기가 방출 용기에 추가되면 스토키네트 슬리브를 닫고 이형 용기의 베젤에 염료 색상, 용기 번호 및 모기의 총 중량을 라벨링 테이프에 표시합니다. 이 대표적인 수컷 성체 Aedes aegypti 모기 사육, 방사선 조사 및 마케팅 실험에서는 3개의 사육 케이지에서 2g의 수컷 성인 모기를 수집하고 2개의 케이지에서 25마리의 수컷으로 구성된 2개의 바이알과 함께 모기당 평균 체중을 계산할 수 있었습니다. 2 개의 배치에서 총 25 마리의 암컷이 폐기되었습니다.
유충 사육 주 동안시기 적절하고 관찰적인 먹이는 분리를 위해 잘 발달 된 번데기를 생성하는 데 중요합니다. 이것은 남성과 여성 사이에 명확한 구별을 생성하여 마킹 단계에서 여성의 발생을 낮게 만듭니다. 운영 SIT 프로그램에서 사용하는 것 외에도이 무균 수컷은 야생 비 조사 수컷과 비교하여 조사 된 짝짓기 경쟁, 생존 및 분산을 조사하는 실험에도 광범위하게 사용될 수 있습니다.
암컷 모기를 포함하도록 기술을 수정하면 번식력 및 벡터 능력과 관련하여 조사 된 암컷의 의도하지 않은 방출의 영향을 조사 할 수 있습니다.
