Уникальная ценность этого протокола заключается в том, что два сотрудника, использующие легкодоступное оборудование в небольших лабораторных помещениях, могут производить достаточно стерильных вредоносных комаров для поддержки оперативной программы SIT площадью 50 акров. Эффективность и низкая стоимость этого метода делает его доступным, трудноразрешимым даже для небольших районов борьбы с комарами для расширения их комплексной программы борьбы с переносчиками. Демонстрировать процедуру будут я и Барбара Байер, лаборант биологических наук из исследовательского подразделения.
Чтобы вырастить взрослых Aedes aegypti из куколок, подготовьте 60 на 60 на 60 сантиметров складные алюминиевые клетки для выращивания с отверстиями размером 0,84 на 0,84 миллиметра из стекловолокна и гильзой на одной вертикальной стенке каждой клетки. Поместите пластиковый стаканчик размером 1 900 миллилитров с куколками Aedes aegypti в соотношении пол один к одному в каждую клетку для выращивания и завяжите рукав закрытым, оставляя чашки в клетках для эклозии в течение примерно четырех дней при температуре от 28 до 30 градусов Цельсия, превышающей относительную влажность более 50% в цикле 12: 12 или 14: 10 свет: темнота, пока больше не появятся взрослые. Через 24 часа после помещения куколок в клетки для выращивания поместите в каждую клетку контейнер с 10%-ным раствором сахарозы с губчатым фитилем и подвешивайте губку размером 10 на 2 сантиметра, смоченную в меде, с проволочного крючка, чтобы обеспечить гидратацию и питание соответственно взрослым комарам.
Через 48-72 часа после того, как большинство взрослых появились каждые два-три дня в течение следующих трех-четырех недель после этого, наполните один презерватив из овечьей кожи от 50 до 100 миллилитров дефибринированной бычьей крови на клетку и согрейте презервативы примерно до 37 градусов по Цельсию в ванне с горячей водой. После тщательного поглаживания презервативов полотенцем поместите частично высушенные презервативы в отдельные бумажные выложенные чашки Петри внутри клеток на 30-60 минут. Через 48-72 часа после каждого кормления кровью поместите чашку яйцекладки объемом 1 900 миллилитров, содержащую 800 миллилитров фильтрованной воды для куколок и снабженную листом бумаги для прорастания семян размером от 8 до 10 на 30 сантиметров, вставленным в заподлицо по внутренней окружности чашки в каждую клетку.
Чтобы вырастить личинок Aedes aegypti из яиц, используйте яйцекладущую бумагу с присутствием от 5 000 до 10 000 яиц и вырежьте трех-семи сантиметровый участок, перпендикулярный линии яйцекладки. Поместите кусок в новый контейнер объемом 460 миллилитров, наполовину заполненный водопроводной водой и щепоткой измельченных хлопьев рыбной пищи. Накройте и перемешайте контейнер энергично в течение по крайней мере одной минуты, прежде чем вылить все содержимое в личиночный поддон для выращивания, содержащий три литра водопроводной воды и 50 миллилитров коричневой суспензии.
Отметьте кастрюлю датой начала, информацией о штамме и графиком кормления. Как только приблизительная пороговая доля личинок в личиночных сковородах будет достигнута, перелейте содержимое каждой кастрюли через сито размером от 20 до 40 и используйте бутылку с водопроводной водой, чтобы вымыть куколок и личинок из сита в трехлитровой градуированный пластиковый стакан. Чтобы отделить самцов куколок от личинок и самок куколок, разделите содержимое каждого стакана между несколькими пластиковыми контейнерами объемом 1,9 литра и поместите жесткий неглубокий четырехлитровый контейнер для сбора под шлюзом у основания сепаратора куколок.
Заполните два трехлитровых градуированных пластиковых стакана примерно на три четверти, заполненных водопроводной водой, и налейте воду через пространство между стеклянными пластинами сепаратора, регулируя верхнюю и нижнюю ручки, чтобы вода непрерывно текла через сепаратор. После того, как стоячая вода собралась равномерно на высоте примерно 1,25 сантиметра от основания пластин, отметьте начальные положения на нижних ручках сепаратора лентой и начните выливать контейнеры с куколками и личинками в сепаратор, непрерывно вращая нижние ручки против часовой стрелки на один-два сантиметра от исходных положений. Когда большинство или все личинки промылись через шлюз в контейнер для сбора, приостановите поток воды и используйте сито номер 30, чтобы очистить контейнер для сбора личинок.
Когда все личинки будут удалены, налейте воду и снова отрегулируйте ручки, чтобы позволить самцам куколок быть смытыми в контейнер для сбора. Затем перелейте самцов куколок из контейнера в сито No 20 и используйте литровую бутылку с водопроводной водой, чтобы промыть куколок из сита в отдельный контейнер объемом 1,9 литра. Когда все мужские куколки будут собраны, налейте воду и отрегулируйте ручки, чтобы позволить собрать самок куколок.
Использование сита no 20 для переноса самок куколок в новый контейнер объемом 1,9 литра, как только что было продемонстрировано. Затем налейте воду и снова отрегулируйте ручки, пока все незрелые комары не будут смыты из сепаратора. Процедите собранные самцы куколок с помощью сита и вымойте какашки в литровый градуированный стакан с как можно меньшим количеством воды.
Аккуратно вылейте куколок в чашки Петри, выстланные влажной фильтровальной бумагой в один слой. Удалите стоячую воду со дна чашки Петри, используя свежую трехмиллилитровую пастбищную пипетку, чтобы предотвратить движение куколки во время работы. Раскладывайте чашки и штабели Петри перед запечатыванием в маркированный 3,8-литровый запечатываемый пакет, чтобы поместиться в камере облучения.
Чтобы отметить количественные партии взрослых облученных самцов комаров, удалите все источники питания из клетки для выращивания и поместите одну клетку в большую камеру углекислого газа на пять-семь минут, выбивая боковые стороны контейнера, чтобы выбить любых комаров, цепляющихся за стенки. В конце периода воздействия перенесите комаров во флакон аспиратора и снова обезболите комаров, прежде чем встряхнуть комаров на рабочей поверхности, покрытой белой бумагой. Осторожно аспирируйте всех самцов с рабочей поверхности в новый флакон и повторяйте экспозиции и сбор до тех пор, пока все взрослые самцы не будут собраны из всех клеток выращивания.
В какой-то момент во время процесса сортировки пола сгенерируйте флакон, содержащий только 25 взрослых самцов комаров. Когда все самцы будут собраны, взвесьте каждого мерзкого комара в смоляной весовой лодке на весах и быстро вылейте взвешенных комаров в 240-миллилитровый картонный контейнер, содержащий 50 миллиграммов маркировочного красителя. Наклоните и поверните контейнер на один полный оборот по часовой стрелке и против часовой стрелки, пока все комары не будут слегка покрыты, и перелейте комаров в новую весовую лодку, затем сложите весовую лодку пополам, чтобы позволить комарам быть направленными через рукав чулки в контейнер для выпуска.
Когда примерно два грамма самцов комаров были добавлены в контейнер для выпуска, завяжите рукав с завязкой и пометьте маркировку лентой на лицевой панели контейнера для выпуска цветом красителя, номером контейнера и общим весом комаров. В этом репрезентативном эксперименте по выращиванию, облучению и маркетингу комаров Aedes aegypti удалось собрать два грамма самцов взрослых комаров из трех клеток для выращивания и вместе с двумя флаконами из 25 самцов из двух клеток, чтобы можно было рассчитать средний вес на комара. Всего из двух партий было выброшено 25 самок.
Своевременное и наблюдательное кормление в течение недели выращивания личинок имеет решающее значение для получения хорошо развитых куколок для отделения. Это порождает четкое различие между самцами и самками, что приводит к низкому уровню встречаемости самок на этапах маркировки. Помимо использования их в оперативных программах SIT, эти стерильные самцы также могут широко использоваться в экспериментах, изучающих брачную конкуренцию, выживание и рассеивание облученных по сравнению с дикими необлученными самцами.
Модификация метода для включения самок комаров позволяет нам исследовать влияние непреднамеренного высвобождения облученных самок в отношении плодовитости и компетентности переносчиков.
