Der einzigartige Wert dieses Protokolls besteht darin, dass zwei Mitarbeiter, die leicht verfügbare Geräte in kleinen Laborräumen verwenden, genügend sterile Malmücken produzieren können, um ein 50 Hektar großes operatives SIT-Programm zu unterstützen. Die Effizienz und die niedrigen Kosten dieser Technik machen es zugänglich, hartnäckig auch für kleine Moskitokontrollbezirke, um ihr integriertes Vektorkontrollprogramm zu erweitern. Das Verfahren demonstrieren ich und Barbara Bayer, biowissenschaftliche Laboranten aus der Forschungsabteilung.
Um erwachsene Aedes aegypti aus Puppen zu züchten, bereiten Sie 60 x 60 mal 60 Zentimeter große zusammenklappbare Aluminium-Aufzuchtkäfige mit 0,84 x 0,84 Millimeter Lochgröße Glasfasergitter und einer Stockinette-Hülle an einer vertikalen Wand jedes Käfigs vor. Stellen Sie einen 1.900-Milliliter-Plastikbecher mit Aedes aegypti-Puppen im Verhältnis eins zu eins in jeden Aufzuchtkäfig und binden Sie den Ärmel zu, wobei die Becher in Käfigen für etwa vier Tage bei 28 bis 30 Grad Celsius mehr als 50% relativer Luftfeuchtigkeit in einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12:12 oder 14:10 Uhr stehen, bis keine Erwachsenen mehr auftauchen. 24 Stunden nachdem Sie die Puppen in die Aufzuchtkäfige gelegt haben, legen Sie einen Behälter mit 10% iger Saccharoselösung mit einem Schwammdocht in jeden Käfig und hängen Sie einen in Honig getränkten 10 x 2 Zentimeter großen Schwamm an einem Drahthaken auf, um den erwachsenen Moskitos Feuchtigkeit und Nahrung zu geben.
48 bis 72 Stunden, nachdem die meisten Erwachsenen in den nächsten drei bis vier Wochen alle zwei bis drei Tage aufgetaucht sind, füllen Sie das eine Lammfellkondom mit 50 bis 100 Milliliter defibriniertem Rinderblut pro Käfig und erwärmen Sie die Kondome in einem heißen Wasserbad auf etwa 37 Grad Celsius. Nachdem Sie die Kondome vorsichtig mit dem Handtuch abgeklopft haben, legen Sie die teilweise getrockneten Kondome für 30 bis 60 Minuten in einzelne mit Papier ausgelegte Petrischalen in die Käfige. Stellen Sie 48 bis 72 Stunden nach jeder Blutfütterung einen 1.900 Milliliter Eiablagebecher mit 800 Milliliter gefiltertem Puppenwasser und versehen mit einem 8 bis 10 mal 30 Zentimeter großen Blatt Samenkeimpapier, das bündig entlang des inneren Umfangs des Bechers in jeden Käfig passt.
Um die Aedes aegypti-Larven aus Eiern zu züchten, verwenden Sie ein Eiablagepapier mit 5.000 bis 10.000 vorhandenen Eiern und schneiden Sie einen drei bis sieben Zentimeter langen Abschnitt senkrecht zur Eiablagelinie. Legen Sie das Stück in einen neuen 460-Milliliter-Behälter, der zur Hälfte mit Leitungswasser und einer Prise pulverisierter Fischfutterflocken gefüllt ist. Decken Sie den Behälter mindestens eine Minute lang ab und rühren Sie ihn kräftig, bevor Sie den gesamten Inhalt in eine Larvenaufzuchtschale gießen, die drei Liter Leitungswasser und 50 Milliliter braune Gülle enthält.
Markieren Sie die Pfanne mit dem Startdatum, den Stamminformationen und dem Fütterungsplan. Sobald der ungefähre Schwellenanteil der Larven in den Larvenpfannen erreicht ist, gießen Sie den Inhalt jeder Pfanne durch ein Sieb der Größe 20 bis 40 und waschen Sie die Puppen und Larven mit einer Quetschflasche Leitungswasser aus dem Sieb in ein drei Liter abgestuftes Plastikbecherglas. Um die männlichen Puppen von den Larven und weiblichen Puppen zu trennen, teilen Sie den Inhalt jedes Becherglases auf mehrere 1,9-Liter-Kunststoffbehälter auf und stellen Sie einen starren, flachen Vier-Liter-Sammelbehälter unter die Schleuse am Boden eines Puppenseparators.
Füllen Sie zwei drei Liter abgestufte Kunststoffbecher etwa zu drei Vierteln mit Leitungswasser und gießen Sie das Wasser durch den Raum zwischen den Glasplatten des Separators, während Sie die oberen und unteren Knöpfe so einstellen, dass das Wasser kontinuierlich durch den Separator fließen kann. Sobald stehendes Wasser gleichmäßig in etwa 1,25 Zentimeter Höhe von der Basis der Platten gesammelt hat, markieren Sie die Startpositionen an den unteren Knöpfen des Separators mit Klebeband und beginnen Sie, die Behälter von Puppen und Larven in den Separator zu gießen, während die unteren Knöpfe kontinuierlich gegen den Uhrzeigersinn ein bis zwei Zentimeter von den Startpositionen entfernt gedreht werden. Wenn die meisten oder alle Larven durch die Schleuse in den Auffangbehälter gespült wurden, unterbrechen Sie den Wasserfluss und verwenden Sie ein Sieb der Nummer 30, um den Auffangbehälter von den Larven zu befreien.
Wenn alle Larven entfernt wurden, gießen Sie das Wasser und stellen Sie die Knöpfe erneut ein, damit die männlichen Puppen in den Sammelbehälter gespült werden können. Dann gießen Sie die männlichen Puppen aus dem Behälter in ein Sieb Nummer 20 und verwenden Sie eine Ein-Liter-Quetschflasche mit Leitungswasser, um die Puppen aus dem Sieb in einen separaten 1,9-Liter-Behälter zu waschen. Wenn alle männlichen Puppen gesammelt wurden, gießen Sie das Wasser und stellen Sie die Knöpfe so ein, dass die weiblichen Puppen gesammelt werden können.
Mit dem Sieb Nummer 20 werden die weiblichen Puppen in einen neuen 1,9-Liter-Behälter überführt, wie gerade demonstriert. Dann gießen Sie das Wasser und stellen Sie die Knöpfe wieder ein, bis alle unreifen Moskitos aus dem Separator gespült wurden. Die gesammelten männlichen Puppen mit einem Sieb abseihen und den Kot mit möglichst wenig Wasser in ein Ein-Liter-Messglas waschen.
Gießen Sie die Puppen vorsichtig in Petrischale, die mit feuchtem Filterpapier in einer einzigen Schicht ausgekleidet sind. Entfernen Sie stehendes Wasser vom Petrischalenboden mit einer frischen Drei-Milliliter-Weidepipette, um Puppenbewegungen während der Arbeit zu verhindern. Bündeln Sie Petrischalen und Stapel, bevor Sie sie in einem beschrifteten 3,8-Liter-wiederverschließbaren Beutel versiegeln, der in die Bestrahlungskammer passt.
Um quantifizierte Chargen von erwachsenen bestrahlten männlichen Moskitos zu markieren, entfernen Sie alle Nahrungsquellen aus dem Aufzuchtkäfig und legen Sie einen Käfig für fünf bis sieben Minuten in eine große Kohlendioxidkammer, wobei Sie die Seiten des Behälters klopfen, um alle an den Wänden haftenden Moskitos zu entfernen. Am Ende der Expositionszeit die Moskitos in ein Aspirator-Fläschchen geben und die Moskitos erneut betäuben, bevor Sie die Moskitos in eine mit weißem Papier bedeckte Arbeitsfläche schütteln. Alle Männchen vorsichtig von der Arbeitsfläche in eine neue Durchstechflasche absaugen und die Belichtung und Entnahme wiederholen, bis alle erwachsenen Männchen aus allen Aufzuchtkäfigen entnommen wurden.
Generieren Sie irgendwann während des Geschlechtssortierprozesses eine Durchstechflasche mit nur 25 erwachsenen männlichen Moskitos. Wenn alle Männchen gesammelt wurden, wiegen Sie jede abscheuliche Moskitos in einem getarnten Wiegeboot auf einer Waage und gießen Sie die gewogenen Moskitos schnell in einen 240-Milliliter-Kartonbehälter, der 50 Milligramm einen Markierungsfarbstoff enthält. Neigen und drehen Sie den Behälter eine volle Umdrehung im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn, bis alle Moskitos leicht beschichtet sind, und gießen Sie die Moskitos in ein neues Wiegeboot, dann falten Sie das Wiegeboot in zwei Hälften, damit die Moskitos durch die Stockinette-Hülle in den Freisetzungsbehälter geleitet werden können.
Wenn ungefähr zwei Gramm männliche Moskitos in den Freisetzungsbehälter gegeben wurden, binden Sie die Stockinette-Hülle zu und markieren Sie das Etikettierband auf der Lünette des Freisetzungsbehälters mit der Farbfarbe, der Behälternummer und dem Gesamtgewicht der Moskitos. In diesem repräsentativen männlichen erwachsenen Aedes aegypti-Mückenaufzucht-, Bestrahlungs- und Marketingexperiment konnten zwei Gramm männliche erwachsene Moskitos aus drei Aufzuchtkäfigen und zusammen mit zwei Fläschchen mit 25 Männchen aus zwei Käfigen gesammelt werden, um das durchschnittliche Gewicht pro Mücke berechnen zu können. Insgesamt wurden 25 Weibchen aus zwei der Chargen weggeworfen.
Eine rechtzeitige und beobachtende Fütterung während der Woche der Larvenaufzucht ist entscheidend für die Erzeugung gut entwickelter Puppen für die Trennung. Dies erzeugt eine klare Unterscheidung zwischen Männchen und Weibchen, was zu einem geringen Vorkommen von Weibchen in den Markierungsschritten führt. Neben der Verwendung in operationellen SIT-Programmen können diese sterilen Männchen auch ausgiebig in Experimenten verwendet werden, die den Paarungswettbewerb, das Überleben und die Verbreitung von bestrahlten im Vergleich zu wilden, nicht bestrahlten Männchen untersuchen.
Die Modifikation der Technik auf weibliche Mücken ermöglicht es uns, die Auswirkungen der unbeabsichtigten Freisetzung bestrahlter Weibchen im Hinblick auf Fruchtbarkeit und Vektorkompetenz zu untersuchen.
