O valor único deste protocolo é que dois funcionários que usam equipamentos prontamente disponíveis em pequenos espaços de laboratório podem produzir mosquitos de mal estéreis suficientes para apoiar um programa operacional de SIT de 50 acres. A eficiência e o baixo custo dessa técnica a tornam acessível, intratável até mesmo para pequenos distritos de controle de mosquitos aumentarem seu programa integrado de controle de vetores. A demonstrar o procedimento estaremos eu e Barbara Bayer, técnicos de laboratório de ciências biológicas da unidade de investigação.
Para criar Aedes aegypti adulto de pupas, prepare gaiolas de metal dobráveis de 60 por 60 por 60 centímetros com peneira de malha de fibra de vidro de 0,84 por 0,84 milímetro e uma manga de stockinette de alcance em uma parede vertical de cada gaiola. Coloque um copo de plástico de 1.900 mililitros com pupas de Aedes aegypti na proporção de um para um sexo em cada gaiola de criação e amarre a manga fechada, deixando os copos em gaiolas para eclosão por cerca de quatro dias a 28 a 30 graus Celsius maiores que 50% de umidade relativa em um ciclo claro:escuro de 12:12 ou 14:10 até que não surjam mais adultos. 24 horas depois de colocar as pupas nas gaiolas de criação, coloque um recipiente de solução de sacarose a 10% com um pavio de esponja em cada gaiola e suspenda uma esponja de 10 por 2 centímetros embebida em mel de um gancho de arame para fornecer hidratação e nutrição, respectivamente, aos mosquitos adultos.
48 a 72 horas após a maioria dos adultos terem surgido a cada dois a três dias durante as próximas três a quatro semanas a partir de então, encha o preservativo de pele de cordeiro com 50 a 100 mililitros de sangue bovino desfibrinado por gaiola e aqueça os preservativos a aproximadamente 37 graus Celsius em um banho de água quente. Depois de acariciar cuidadosamente os preservativos com a toalha, coloque os preservativos parcialmente secos em placas de Petri forradas de papel individuais dentro das gaiolas por 30 a 60 minutos. 48 a 72 horas após cada alimentação de sangue, colocar um copo de oviposição de 1.900 mililitros contendo 800 mililitros de água de pupa filtrada e equipado com uma folha de 8 a 10 por 30 centímetros de papel germinativo de sementes encaixado ao longo da circunferência interna do copo em cada gaiola.
Para retirar as larvas de Aedes aegypti dos ovos, use um papel de oviposição com 5.000 a 10.000 ovos presentes e corte uma seção de três a sete centímetros perpendicular à linha de oviposição. Coloque a peça em um novo recipiente de 460 mililitros meio cheio de água da torneira e uma pitada de flocos de comida de peixe pulverizados. Cubra e agite vigorosamente o recipiente durante pelo menos um minuto antes de despejar todo o conteúdo numa panela de criação larval contendo três litros de água da torneira e 50 mililitros de pasta castanha.
Marque a panela com a data de início, as informações de tensão e o cronograma de alimentação. Uma vez que a proporção limiar aproximada de larvas nas panelas larvais tenha sido atingida, despeje o conteúdo de cada panela através de uma peneira de tamanho 20 a 40 e use uma garrafa de água da torneira para lavar as pupas e larvas da peneira em um copo de plástico graduado de três litros. Para separar as pupas machos das larvas e pupas fêmeas, divida o conteúdo de cada copo entre vários recipientes de plástico de 1,9 litro e coloque um recipiente de coleta rígido raso de quatro litros abaixo da eclusa na base de um separador de pupa.
Encha dois copos de plástico graduados de três litros cerca de três quartos cheios de água da torneira e despeje a água através do espaço entre as placas de vidro do separador enquanto ajusta os botões superior e inferior para permitir que a água flua continuamente através do separador. Uma vez que a água parada tenha se acumulado uniformemente a uma altura de aproximadamente 1,25 centímetro da base das placas, marque as posições iniciais nos botões inferiores do separador com fita adesiva e comece a despejar os recipientes de pupas e larvas no separador enquanto gira continuamente os botões inferiores no sentido anti-horário, de um a dois centímetros das posições iniciais. Quando a maioria ou todas as larvas tiverem lavado a eclusa para o recipiente de coleta, pause o fluxo de água e use uma peneira número 30 para limpar o recipiente de coleta das larvas.
Quando todas as larvas tiverem sido removidas, despeje a água e ajuste os botões novamente para permitir que as pupas machos sejam despejadas no recipiente de coleta. Em seguida, despeje as pupas machos do recipiente em uma peneira número 20 e use uma garrafa de um litro de água da torneira para lavar as pupas da peneira em um recipiente separado de 1,9 litro. Quando todas as pupas machos tiverem sido coletadas, despeje a água e ajuste os botões para permitir que as pupas fêmeas sejam coletadas.
Usando a peneira número 20 para transferir as pupas fêmeas para um novo recipiente de 1,9 litro, como acabou de demonstrar. Em seguida, despeje a água e ajuste os botões novamente até que todos os mosquitos imaturos tenham sido lavados para fora do separador. Coe as pupas machos coletadas com uma peneira e lave o cocô em um copo graduado de um litro com o mínimo de água possível.
Despeje cuidadosamente as pupas em placas de Petri forradas com papel de filtro úmido em uma única camada. Remova a água parada do fundo da placa de Petri usando uma pipeta de pastagem fresca de três mililitros para evitar o movimento da pupa durante o trabalho. Empacote as placas de Petri e as pilhas antes de selar dentro de um saco resealable de 3,8 litros rotulado para caber na câmara de irradiação.
Para marcar lotes quantificados de mosquitos machos adultos irradiados, remova quaisquer fontes de nutrição da gaiola de criação e coloque uma gaiola em uma grande câmara de dióxido de carbono por cinco a sete minutos, batendo nas laterais do recipiente para desalojar quaisquer mosquitos agarrados às paredes. No final do período de exposição, transfira os mosquitos para um frasco de aspirador e anestesiar os mosquitos novamente antes de agitar os mosquitos em uma superfície de trabalho coberta de papel branco. Aspirar cuidadosamente todos os machos da superfície de trabalho para um novo frasco para injetáveis e repetir as exposições e a recolha até que todos os machos adultos tenham sido recolhidos de todas as gaiolas de criação.
Em algum momento durante o processo de classificação sexual, gere um frasco contendo apenas 25 mosquitos machos adultos. Quando todos os machos tiverem sido coletados, pese cada vil de mosquitos em um barco de pesagem alcatroado em uma balança e despeje rapidamente os mosquitos pesados em um recipiente de cartolina de 240 mililitros contendo 50 miligramas de um corante de marcação. Incline e gire o recipiente uma rotação completa no sentido horário e anti-horário até que todos os mosquitos tenham sido levemente revestidos e despeje os mosquitos em um novo barco de pesagem, em seguida, dobre o barco de pesagem ao meio para permitir que os mosquitos sejam canalizados através da manga da stockinette para o recipiente de liberação.
Quando aproximadamente dois gramas de mosquitos machos tiverem sido adicionados ao recipiente de liberação, amarre a manga da stockinette fechada e marque a fita de rotulagem no painel do recipiente de liberação com a cor do corante, o número do recipiente e o peso total dos mosquitos. Neste experimento representativo de criação, irradiação e comercialização de mosquitos adultos machos Aedes aegypti, dois gramas de mosquitos adultos machos puderam ser coletados de três gaiolas de criação e juntamente com dois frascos de 25 machos de duas gaiolas para permitir o cálculo do peso médio por mosquito. No total, 25 fêmeas foram descartadas de dois dos lotes.
A alimentação oportuna e observacional durante a semana de criação larval é fundamental para a geração de pupas bem desenvolvidas para separação. Isso gera uma clara distinção entre machos e fêmeas, levando a uma baixa ocorrência de fêmeas nos passos de marcação. Além de usá-los em programas operacionais de SIT, esses machos estéreis também podem ser amplamente utilizados em experimentos que investigam a competição de acasalamento, sobrevivência e dispersão de machos irradiados em comparação com machos selvagens não irradiados.
Modificar a técnica para incluir mosquitos fêmeas nos permite investigar o impacto da liberação não intencional de fêmeas irradiadas no que diz respeito à fecundidade e competência vetorial.
