レギノンを用いたステージチルトを用いた単粒子クライオ電子顕微鏡データ収集

試料ステージを傾けると、単一粒子クライオEMデータ収集中の粒子の配向分布を増加させる簡単で一般化可能な方法が提供されます。標本ステージの傾きによって得られる粒子の均一な分布により、全体的なマップの品質と解釈性が向上します。顕微鏡の位置を合わせることから始めて、標本の平行照明を確保し、コマ収差を最小限に抑えます。

データ収集に適した正方形を特定するには、ステージチルトなしまたはステージチルトのあるグリッドアトラスを記録し、全体的なグリッド品質の概要とデータ収集に適した領域の初期表示を提供します。正方形取得ノードで使用される倍率で正方形を手動で検査します。ホイルが無傷で、脱水状態ではなく、理想的な氷の厚さがある正方形を探し、試験片ステージを目的の正方形に移動します。

ステージ位置のユーセントリック高さを約15度のステージ傾斜でアルファワブラーを使用して決定し、顕微鏡のキーパッドパネルを使用してステージをユーセントリック高さになるようにZ高さを調整します。アルファウォブルルーチン中の画像シフトが最小限であることを確認します。より正確なZ高さを見つけるには、正方形取得ノードで使用される倍率でフォーカサーノードで推定します。

フォーカサーノードの設定を調整し、正方形の初期キューイング中に細かいZフォーカスオプションを有効または無効にします。次に、[シミュレート]を押します。真のユーセントリック高さでデータ収集のために、試料ステージを希望の傾斜角度に傾け、必要に応じてステージを再センタリングします。

正方形の集録ノードで[シミュレート]を押して、集録ノード全体のエクスポージャーのターゲットのキューイングを開始します。次に、Zフォーカスターゲットと高倍率露光に適した穴のある領域を選択し、ターゲットをイメージング用のキューに送信します。試験片ステージを傾けていない状態に戻し、次の正方形に移動します。

十分な数の露出全体がキューに入れられるまで、これらの手順を繰り返します。すべてのマスがキューに入れられたら、ターゲットノード全体に移動し、[キューに入れられたターゲットの送信]を押します。ノード設定で選択したターゲットのユーザー検証を許可するを選択し、高倍率露光取得ノードによって選択されたターゲットを手動で検査して、自動EMホールファインダーが試料ステージを傾けたときに画像取得に適した領域を正確に識別できるかどうかをテストします。

ユーザーがターゲティングの精度に満足したら、自動データ収集の [選択したターゲットのユーザー確認を許可する] オプションをオフにします。ここでは、ユーセントリックZ高さの近くと遠くで収集された異なる傾斜角での正方形倍率でのグリッドの代表的な画像を示します。ビームの中心は赤い同心円リングの中心で示され、緑の矢印は対象の正方形を示します。

参照用に関心のある正方形に隣接して壊れたグリッド フィーチャがあります。ここに示されているのは、0度、30度、および60度の傾斜角度で収集された代表的な穴露出と2Dクラス平均です。タンパク質濃度は異なる傾斜角にわたって変化しませんが、傾斜角を高くすると、画像化された領域が粒子濃度の点でより混雑しているように見えます。

過密の影響を受ける 2D クラス平均は、この赤いボックスに表示されます。プロトコルのシンプルさにより、顕微鏡の標準的なユーザーは、傾斜したデータ収集戦略を簡単に適応させることができます。