小シグナル伝達分子は、細菌の毒性およびヒト生物学を制御するために、様々なエフェクタータンパク質を標的とする。しかし、これらのエフェクタータンパク質は同定するのが難しい。システム生物学ツールとして、DRaCALAはOViumライブラリを使用して、未知のエフェクタータンパク質の実現可能かつ迅速かつ高感度な同定を可能にします。
DRaCALAは、放射性同位体または蛍光色素のいずれかで標識できる限り、任意の小さなシグナル伝達分子を研究するために使用することができます。大腸菌を1.5ミリリットルのLBに接種し、96ウェルの深いウェルプレートの各ウェルに1ミリリットルのクロラムフェニコールあたり25マイクログラムを加え、摂氏30度と毎分160回転で一晩インキュベーションを行います。翌朝、500マイクロモルIPTGで一晩培養した培養物を摂氏30度で6時間処理し、タンパク質発現を誘導する。
インキュベーションの終わりに、遠心分離によって細胞をペレットにし、上清を取り除き、サンプルをマイナス80°Cで凍結する。リシスを開始するには、150マイクロリットルのライシスバッファーでペレットを1ウェルあたり1回再中断し、マイナス80°Cで30分のインキュベーションを行い、セルを摂氏37度で20分間解凍します。ライセートは、使用前にマイナス80°Cで保存する必要があります。
過剰発現タンパク質を含む細胞のリシスを完了するには、氷冷ライシスバッファー2の40ミリリットルでサンプルを再中断し、8分間4秒間2秒間で60%振幅でサンプルを超音波処理し、遠心分離によってリセートをクリアします。サンプルが遠心分離されている間、均質化ニッケルNTA樹脂の500マイクロリットルを立ち位置のポリプロピレンクロマトグラフィーカラムに加えます。15分後、15ミリリットルの超純水で落ち着いた樹脂を2回洗浄し、15ミリリットルの溶精緩衝液2で1回洗浄します。
遠心分離の終わりに、クリアしたlysate上清をカラムにロードします。すべてのライセートがカラムを流れたとき、30ミリリットルの洗浄バッファーでカラムを洗います。タンパク質を溶出させるために、400マイクロリットルの溶出バッファーをカラムに加え、溶出を3回繰り返します。
溶出バッファーの別の 300 マイクロリットルの体積は溶出を 3 回繰り返し、溶出したタンパク質を最終的な体積 700 マイクロリットルに結合します。溶出した試料のゲル濾過については、調製したゲル濾過バッファーの25ミリリットルでサイズ排除カラムを洗浄した後、500マイクロリットルのループを用いて溶出したタンパク質の全容をカラムにロードする。1分あたり500マイクロリットルで実行し、それぞれのタンパク質の2〜3つの500マイクロリットル体積分率を収集します。
次に、個々のスピンカラムを使用して各タンパク質を濃縮し、ブラッドフォードアッセイキットを使用して、標準的なプロトコルに従ってタンパク質濃度を測定します。五リン酸グアノシンとラベル付けされたリン32を合成するには、テーブルに概説されているようにねじキャップチューブに小規模なRelseq反応を組み立て、ThermoMixerで反応を摂氏37度で1時間、摂氏95度で5分間インキュベートし、氷の上で5分間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、遠心分離によって沈殿したタンパク質をスピンダウンし、上澄み物を含む合成リン32標識されたグアノシンペンタリン酸を新しいスクリューキャップチューブに移す。
リン32グアノシンテトラリン酸合成の場合、新しいねじキャップチューブにグアノシンペンタリン酸製品とラベル付けされたリン32の半分に1つのマイクロモルGppAを加え、37°Cで10分間、摂氏95度で5分、氷上で5分間反応をインキュベートします。インキュベーションの終わりに、遠心分離によって沈殿をスピンダウンし、上清を含むグアノシン四リン酸を標識したリン32を新しいチューブに移す。単離された標的タンパク質を分析するには、移動相として1.5モルモノカリウムリン酸を使用して、薄層クロマトグラフィープレート上で各サンプルの1マイクロリットルを実行します。
分析後、乾燥したプレートを透明なプラスチックフォルダに入れ、5分間保管用の蛍光体スクリーンにプレートを露出させてから、蛍光体の画像装置上のデータを視覚化して定量します。標的タンパク質のDRaCALAスクリーニングでは、解凍した卸売ライセートの20マイクロリットルを95ウェルVボトムマイクロタイタープレートの個々のウェルに追加し、各ウェルにセラチア・マルセセンス・エンドヌクレアーゼの2.5単位を追加します。摂氏37度で15分後、氷の上に20分間ライセートを置きます。
次に、五リン酸グアノシンとグアノシンテトラリン酸と標識したリン32の等量を混合し、1X溶解バッファーを混合物に加えて、4ナノモルグアノシン五タンリン酸溶液を得る。マルチチャンネルピペットとフィルター処理されたピペットチップを使用して、グアノシンペンタリン酸混合物の10マイクロリットルを細胞リセートと混合し、室温で5分間インキュベーションします。インキュベーションの最後に、96Xピンツールを非イオン洗剤の0.01%溶液で3回30秒間洗浄し、その後、96ウェルサンプルプレートにピンツールを入れる前に、1回のペーパータオルで30秒間乾燥します。
30秒後、ピンツールをまっすぐ上に持ち上げ、ニトロセルロース膜の上に30秒間まっすぐ下に置きます。5分間の乾燥の後、ニトロセルロース膜を透明なプラスチックフォルダに入れて、蛍光体スクリーン暴露を記憶し、示すように蛍光体イメージングによる可視化を行います。潜在的な標的タンパク質を定量化して同定するために、蛍光体イメージャーに関連付けられた解析ソフトウェアで、視覚化されたプレートのゲルファイルを開きます。
分析するスポットを定義するには、配列分析関数を使用して、12 列を 8 行グリッドで設定します。穴のスポットの外側のエッジを囲むには、大きな円を定義し、ボリュームと定義された大きな円の背景と面積をスプレッドシートにエクスポートします。小さな内側のドットを囲むには、定義された円を下にサイズ設定し、定義された小さな円のボリュームと背景と領域をエクスポートし、スプレッドシートにすべてのデータを保存します。
必要に応じて、円をスポットと重なるように配置し、実際のスポットよりもわずかに大きいサイズを変更します。数式を使用して、スプレッドシート内の結合分数を計算し、データをプロットします。次に、他のウェルの大部分と比較して高い結合画分を示すウェル内の潜在的な結合タンパク質を同定する。
この代表的な分析では、ほとんどのウェルで比較的低いバックグラウンド結合信号を有するプレートが観察される。ウェルH3における陽性結合シグナルは、グアノシンペンタリン酸結合タンパク質Hptの過剰発現により他のウェルについて観察されたものよりもはるかに高い結合分率を示した。代表的なプレートでは、いくつかのウェルは、多くのウェルで観察される比較的強い内ドットによって示されるように比較的高いバックグラウンド結合信号を示し、定量後に観察された一貫して高い結合画分を示した。
特に、一部のターゲットは、偽陽性などの可変的な結合分数を与えました。さらに明確にするために、研究者は精製タンパク質を使用して結合を再びテストしました。標的タンパク質が同定されると、タンパク質を均質に精製し、DRaCALA、等温滴定熱量測定、またはその他の方法を使用して相互作用強度と特異性を確認することができます。
小シグナル伝達分子の標的タンパク質を同定することは、細菌性毒性からヒト生物学に至る役割の詳細な理解への道を開く。
