褐色脂肪組織の生物学的側面を調べるためには、精製された褐色脂肪サイズをクリアすることが不可欠です。現在、褐色脂肪サイズの精製は行われておらず、質量が利用可能です。この研究では、この問題に対処するための簡単なプロトコルを開発しました。
現在、このプロトコルには1つのスキルが必要です。他の方法よりもはるかに少ない研究材料を必要とし、精製された褐色脂肪サイズは遺伝子およびタンパク質発現分析に直接使用できます。このプロトコルは、古典的な褐色脂肪サイズの生物学を研究するための新しい方法を提供します。
また、白色脂肪細胞の褐変過程の研究にも適用することができる。手順を実演するのは、私の研究室の研究助手であるアマンダです。BATと消化溶液を入れたフラスコを、摂氏35度のインキュベーター内で毎分60回転のマグネチックスターラーに30分間置くことから始めます。
1ミリリットルのピペットを使用して、スターラーバーの周りのBATスライスの凝集組織塊を破壊します。消化後、清潔な50ミリリットルの遠沈管の上に70マイクロメートルのストレーナーフィルターを置き、ストレーナーを通して約4ミリリットルの細胞懸濁液をピペットで送ります。次に、4ミリリットルの12%ヨージキサノール溶液で洗浄します。
ピペットを上下に動かして細胞をヨージキサノール溶液と混合し、細胞混合物を2本の透明な5ミリリットルのポリスチレン試験管に移します。セル混合物を含むポリスチレンチューブを氷上に1時間置き、BAを上部に層を形成します。顕微鏡検査のために20マイクロリットルの分離されたBAを取り出します。
RNAとタンパク質を単離するには、BA層を2本の1.7ミリリットルのマイクロセンターフュージチューブにピペットで入れます。次に、BA層を乱すことなく、過剰なヨウ素溶液を慎重に除去します。次に、1ミリリットルのTRIzolを細胞溶液に加え、RNA、DNA、およびタンパク質を同時に分離し、細胞を溶解するのに十分な混合を行います。
相を分離するには、200マイクロリットルのクロロホルムと遠心分離機を9, 981 Gで摂氏4度で10分間チューブに加えます。遠心分離後、RNA単離には水相を使用します。300マイクロリットルの有機相を2ミリリットルの微量遠心チューブに移し、750マイクロリットルの100%エタノールを加える。
10秒間ボルテックスした後、200マイクロリットルの1-ブロモ-3-クロロプロパンを加え、再び10秒間ボルテックスします。600マイクロリットルの二重蒸留水を加えてから、10秒間ボルテックスします。混合溶液を室温で10分間放置する。
遠心分離後、摂氏4度で10分間9, 981 Gを加えます。相は、中間層に局在するタンパク質相と分離されます。一番上の水溶液を取り除き、残りの溶液に1ミリリットルの100%エタノールを加えます。
摂氏4度で10分間9, 981 gで遠心分離した後、上清を捨て、ペレットを1ミリリットルの100%エタノールで洗浄します。摂氏4度で10分間9, 981 gで遠心分離します。上澄み液を除去した後、ペレットを室温で10分間風乾し、湿潤ペレットの重量を測定する。
ペレット1ミリグラムあたり20マイクロリットルの比率で1%SDS溶液を追加します。チューブを摂氏55度と11Gの加熱シェーカーに5〜10分間入れて、ペレットを完全に溶解します。プロトコルでは、3%BSAを含むPBSを使用してBAをBATから分離しました。
単離された細胞はラズベリー型で、内部に多房性脂肪滴があり、tdTom陽性であり、BAであることが確認されました。タンパク質は、改良されたGTPCプロトコルを用いてBAから単離され、次いでSDS-PAGEゲルで検査された。BSAに関連する優勢なバンドがBAサンプルで観察され、タンパク質抽出におけるBSAの干渉を示唆しています。
BSA干渉を回避するために、典型的なラズベリー形状を有し、多房性脂肪滴を含むBAの単離に6%ヨージキソナール溶液を使用した。これらのBAから抽出されたタンパク質は、SDS-PAGEゲル中で十分に分離された。これらの細胞はtdTomato陽性であるのに対し、ペレットから回収された細胞はtdTomatoes陰性であり、明らかな脂肪滴はなく、非脂肪細胞からのBAの効率的な分離が示唆された。
遺伝子発現解析では、UCP1およびPDGFAのmRNAレベルは、単離されたBAで有意に高かった。しかし、PDGFRAのmRNAはBATでのみ検出されました。UCP1タンパク質は、単離されたBAに富んでいることがわかりました。
EDGFRアルファはBATでは検出されましたが、単離されたBAでは検出されませんでした。これらの結果は、BAの単離方法の効率を確認し、単離されたBAが遺伝子およびタンパク質発現研究に適していることを示しています。このプロトコルを試みるときは、新鮮な消化バッファーを使用して褐色脂肪組織を解離し、消化期間中の組織塊の形成を回避します。
この新しい方法により、単一細胞タップレベルで褐色脂肪組織の生物学を簡単に調査できます。この方法を応用することで、褐色脂肪細胞遺伝子発現プログラムを精密に解剖した純褐色脂肪細胞を用いたGNおよびタンパク質発現研究を、もともと無脂肪細胞由来のコンタミネーションを心配することなく行うことができる。
