このプロトコルは、生物学的機能との関連性の集合的な膜変動と脂質膜の実用化に関する中性子スピンエコー研究の成功に必要なサンプル調製とデータ削減について説明する。NSEは、他の技術ではアクセスできない選択的膜特徴を探査するための同位体感度のユニークな利点を持つ主要な膜機能のナノ秒のタイムスケール上の膜ダイナミクスに直接アクセスします。ナノスケールにおける膜動態の研究は、様々な細胞病理に関係する分子機構の基礎となる膜特性および膜-タンパク質相互作用を理解するために不可欠である。
この方法は、NSEに新しい研究者に、実験の成功とその後のデータ削減分析と解釈のための脂質小胞の設計、準備、特徴付けに関する詳細なガイドラインを提供します。この手順のデモンストレーションは、テシャニ・クマージュとジュリー・グエン、大学院生と研究室の学部生になります。フードの内部で作業し、正確に秤量した脂質を1ミリリットルの溶媒に手動混合で溶解して脂質懸濁液を調製します。
不活性ガスをバイアル内でゆっくり流しながら、脂質溶液をゆっくり回転させて乾燥させます。残留溶媒を完全に除去するには、バイアルを摂氏35度の真空オーブンに一晩置きます。翌日、重水2ミリリットルで脂質膜を水和し、1ミリリットル当たり50ミリグラムの脂質濃度を得、水和脂質懸濁液をボルテックスして、脂質膜が完全に溶解するまで水和した脂質懸濁液を得る。
次に、水分補給脂質懸濁液のバイアルをマイナス80°Cで凍結するまで保存して、5回凍結融解サイクルを行う。そして、脂質懸濁液を解凍するために摂氏35度の水浴にそれを移す。次のサイクルに進む前に均質になるまで解凍懸濁液を渦液。
実験を開始する前に、2つの膜支持体の間にポリ炭酸塩膜を使用して押出機のセットアップを組み立て、各側に2つのペーパーフィルターを追加してサポートを追加します。気密性ガラス注射器を使用して、膜アセンブリを通して0.3ミリリットルの重水を数回通過させることで、ポリカーボネート膜を水和します。膜を水和した後、調製した乳白色の脂質溶液を備えた1ミリリットルの気密注射器を一端に挿入し、空のシリンジを押出機装置の反対側端に挿入します。
シリンジが接続されたら、アセンブリを押出機ブロックに配置します。[Rate]ボタンを押したまま押し出し速度を入力し、[直径]ボタンを押してシリンジ径を入力してポンプをプログラムします。次に、ライトが点灯するまで[取り消す]を押します。
start を押して、サンプルが空のシリンジに分配し始めるのを待ちます。サンプルの注射器が完全に空になる直前に、停止ボタンを押します。分配されたボリュームを記録し、フェーズ1が画面に表示されるまでRateボタンを押したままにします。
取り出しのライトをオフにしたまま、ボリュームボタンを押して、先ほど録音した分配ボリュームを入力します。もう一度 Rate ボタンを押し、フェーズ 2 にアクセスするには、最も上矢印を使用します。ボリュームを押して、先ほど記録した分配ボリュームの同じ値を入力します。
このフェーズでは、取り消しライトが点灯するまで[取り消し]ボタンを押します。LP:SE が画面に表示されるまで音量ボタンを押してフェーズ3のサイクルを繰り返し、20 に設定します。最後に、Rateボタンを押してフェーズ4にアクセスし、音量ボタンを押して停止機能に到達し、ポンプのセットアップを完了します。
ポンプがプログラムされたら、押し出しサイクルを開始するために開始を押します。15~20回押し出しサイクルを行ってから、透明なオパールブルーの押出脂質懸濁液をクリーンバイアルで回収して測定を行います。DAVEソフトウェアを開き、データ削減メニューからNSEデータを減らすを選択します。
ファイルメニューからエコーファイルを開くを使用して、異なるQ値でデータファイルをアップロードします。アップロードされたファイルは、使用可能なデータセットの下に表示されます。選択したファイルを右クリックし、それに対応する測定に従ってラベルを付けます( [サンプル]、[セル]、または [解像度])。
[データセット]タブを使用して、検出器のピクセルを2 X 2でグループ化して、信号対雑音比を改善します。解像度、セル、およびサンプルのすべてのファイルに同じビンを適用します。すべてのピクセルグループのデータを検査し、キーボードのEndキーを押して、信号が悪いデータをマスクします。
Enter キーを押してポップアップ ウィンドウにアクセスし、4 つの時間すべてに同じマスクを適用します。マスクされたピクセルは緑色に変わります。収集されたデータがエコー信号の形式であることを確認します。
アップロードしたファイルリストから解像度ファイルのフィッティングを開始するには、目的のファイルを右クリックし、ポップアップメニューから「フィット操作」「エコーの解像度にフィット」を選択します。エコー信号の適合が適切なパラメータを得ることを確認します。検出器全体で各継ぎ手パラメータに関連付けられたエラーを検査するには、[イメージ オプション]を選択し、目的の継ぎ手パラメータを選択します。
次に、検出画像を右クリックして、エラーバーマップを示すポップアップウィンドウにアクセスします。特定のピクセルに対するフィット感が不十分な場合は、そのピクセルを選択し、[フィッティング]タブを押して[フィット ピクセル]を押して、そのピクセルの上に信号を再フィットします。[継ぎ手]タブで、フェーズと期間の新しい開始パラメータを入力します。
アップロードされたファイルリストとラベル付きファイルリストから対応するファイルを選択して、サンプルファイルを削減します。すべてのピクセルを検査し、上記のように貧弱なものをマスクします。次に、ファイルを右クリックし、フィット操作、フェーズのインポートを選択します。
解像度ファイルの場合は、前に説明したとおりに、周期の値を変更せずにエコー信号にフィットし、解像度から読み込んだエコーフェーズポイントをフィットさせます。[一般]タブにアクセスし、実験から記録された X および Y のビーム中心値を入力して、すべてのデータ ファイルのビーム中心を入力します。適合が完了したら、適合ファイルのリストから目的のサンプルファイルを右クリックし、ポップアップメニューから「Q のIを計算」を選択して、正規化された中間スキャッタリング関数を計算します。
解像度ファイルとセルファイルに必要な情報と、ポップアップウィンドウにQ-arcsの数を入力し、[OK]を押して結果を表示します。シアンのデータは、検出部のエッジ効果による信号が悪く、異なるQデータセットをコンパイルする際に除去する必要があることに注意してください。最後に、削減されたデータ・セットを ASCII ファイルとして保存し、セッション全体を DAVE プロジェクトとして目的のフォルダーに保存します。
本研究では、異なる重水素化スキームで調製したリポソームサンプルのNSE測定を行った。膜屈曲の変動のNSE測定は、完全に対照的なリポソームに対して行われる。この重水素化スキームは、膜コアと重水素化流体環境との間に大きな散乱長差をもたらし、リポソーム膜からの散乱信号を有意に増強し、曲げダイナミクスの測定統計を改善する。
一方、リポソームの膜厚変動のNSE測定では、曲げ変動の第3依存性に対するQに対する偏差が示される。厚さゆら信号を分離するために、得られた信号をQで3番目に分割し、過剰なダイナミクスがQ.のローレンツィアン関数に適合します。NSEが調査するダイナミクスは、重水素NMRリラクソーム法と分子動的シミュレーションによって相乗的に探求され、分子脂質構造とパッキングモチーフが膜機能にどのような影響を与えるかを示すことができます。
NSEの脂質膜に関する研究は、膜生物物理学、膜構造とダイナミクスの複雑な関係、およびそれらが膜機能および膜タンパク質相互作用にどのように影響するかを新たな光を当てた。
